茶樹中與氨基酸合成相關(guān)的三個(gè)基因的克隆與分析.pdf

1、在構(gòu)建茶樹幼根cDNA文庫獲得相關(guān)EST序列的基礎(chǔ)上，通過SMARTRACEPCR技術(shù)獲得了茶樹中谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase，GS1-1、GS1-2)及精氨酸脫羧酶(Argininedecarboxylase，ADC)基因的cDNA全長(zhǎng)序列。
　　 GS1-1基因的3’端序列與已知的EST序列拼接后得到大小為2906bp的cDNA序列，其開放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)為2532bp，共編碼843個(gè)氨基酸，分

2、子量為93.553kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.258。該蛋白質(zhì)的a螺旋結(jié)構(gòu)是41.52％，B螺旋結(jié)構(gòu)是10.79％，無規(guī)則卷曲及其它結(jié)構(gòu)為47.69％，其中無規(guī)則卷曲是整個(gè)蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件，a螺旋其次，β折疊最少。GS1-1蛋白為親水性非分泌不穩(wěn)定蛋白，跨膜方向是由內(nèi)向外，無信號(hào)肽序列存在，共有31個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，是細(xì)胞核蛋白?；蚍肿舆M(jìn)化分析表明其與葡萄的親緣關(guān)系較近。
　　 GS1-2基因的cDNA全長(zhǎng)序列共171

3、0bp，ORF全長(zhǎng)為1071bp，共編碼356個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為39.34kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為5.65。GS1-2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋結(jié)構(gòu)占26.29％，β折疊結(jié)構(gòu)占23.03％，無規(guī)則卷曲及其它結(jié)構(gòu)為50.28％，其中無規(guī)則卷曲是GS1-2蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)中的主要結(jié)構(gòu)元件，α螺旋和β折疊散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。GS1-2蛋白為親水性非分泌不穩(wěn)定蛋白，不跨膜運(yùn)動(dòng)，無信號(hào)肽序列存在，共有27個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，存在于過氧化物

4、酶體?；蚍肿舆M(jìn)化分析表明其與葡萄的親緣關(guān)系較近。
　　 ADC基因cDNA全長(zhǎng)為2988bp，開放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)為2163bp，共編碼720個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)的分子量為77.430kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為5.373，其序列中不存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。ADC蛋白為親水性非分泌不穩(wěn)定蛋白，不跨膜運(yùn)動(dòng)，無信號(hào)肽序列存在，共有41個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，存在于葉綠體基質(zhì)中，是細(xì)胞質(zhì)蛋白。基因分子進(jìn)化分析表明其與碧桃和蘋果的ADC親

5、緣關(guān)系較近。
　　 成功構(gòu)建了以pET32a為載體及。Rosetta為宿主菌的原核表達(dá)體系，經(jīng)1mM濃度的IPTG，37℃，4h誘導(dǎo)后得到了分子量大小為39.5kDa的蛋白，與預(yù)測(cè)的GS1-2蛋白39.34kDa大小相符。通過凝膠成像分析系統(tǒng)定量分析可知，重組蛋白約占菌體總蛋白的47.1％。
　　 GS1-1、GS1-2及ADC基因cDNA全長(zhǎng)序列的獲得及GS1-2基因的初步原核表達(dá)，對(duì)于進(jìn)一步研究GS和ADC在茶樹氮代