采用位置候選與比較基因組法分離、鑒定豬三個脂肪沉積相關(guān)基因.pdf

1、隨著科技進步和社會生產(chǎn)的發(fā)展,豬的育種方法也在不斷改進,以功能基因組學、分子標記輔助育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等分子育種技術(shù)逐步與傳統(tǒng)的育種方法緊密結(jié)合并作為生物科技的前沿領(lǐng)域,已成為當代豬育種的重要方向。大量生物信息學的發(fā)展和公共數(shù)據(jù)資源庫的共享,為分離、定位和篩選具有影響豬性狀的基因提供了新的思路。本論文通過候選基因的方法,并結(jié)合豬的EST信息和比較基因組的策略,分離鑒定豬3個與脂肪沉積相關(guān)的新基因,并對基因與部分性狀進行了關(guān)聯(lián)分析和結(jié)構(gòu)功能

2、域的預(yù)測,取得了如下結(jié)果:
　　 1.依據(jù)候選基因法,通過豬EST信息庫釣取從GenBank中搜索豬的同源EST,由EST構(gòu)成的連接群(contig)設(shè)計引物,從通城豬基因組中分離克隆三個基因片段為:過氧化物2,3-二烯酰CoA異構(gòu)酶(PECI)、wingless-type MMTV integrationsite family,member10B(WNT10B)、dickkopf homolog1(DKK1)基因,將DNA序列

3、提交到NCBI的GenBank,GenBank收錄號分別為DQ291159,DQ518413,DQ517932。
　　 2.通過電腦克隆策略結(jié)合RACE技術(shù),獲得了PECI基因的全長cDNA,通過結(jié)合豬EST信息擴增測序出較完整的豬DKK1基因的基因組信息,并分別對相應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能進行了初步分析和預(yù)測。豬的PECI、DKK1基因的氨基酸序列與人的該氨基酸序列同源性分別達81％和84％。
　　 3.采用

4、半定量RT-PCR方法檢測了PECI、WNT10B和DKK1基因在豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、脂肪等七個組織中的表達情況,結(jié)果表明PECI基因在所檢測的組織中廣泛表達,WNT10B和DKK1基因在脂肪組織中表達量相對較高,為了解早期胚胎期該基因在肌肉中的分布情況,對PECI和DKK1基因進行了時空表達譜分析,研究表明PECI基因在早期的表達是一個上升的過程,而對于DKK1基因早期只在肺臟組織中表達。
　　 4.對PEC

5、I基因和DKK1兩個基因的氨基酸序列進行了功能結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)、親水性和疏水性的預(yù)測,利用網(wǎng)上CLUSTAL軟件進行多序列比對,采用DNASar軟件的CLUSTAL W方法進行相關(guān)的進化樹分析。
　　 5.用豬×嚙齒類體細胞雜種板和豬×倉鼠輻射雜種板將新分離的3個基因分別進行了染色體的區(qū)域定位和精細定位。定位結(jié)果如下:PECI基因定位于SSC7p13,與S0383緊密連鎖,LOD=12.84；WNT10B基因定位于SSC5p11

6、-p15,與SW439緊密連鎖,LOD=5.09；DKK1基因定位于SSC14q25-q26,與SW1552緊密連鎖,LOD=6.74。
　　 6.采用PCR-RFLP方法檢測了PECI、WNT10B兩個基因3’-UTR區(qū)的多態(tài)性并進行了其與豬生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):①PEC1基因PvuⅡ-RFLP位點不同基因型在臀部背膘厚、平均背膘厚和肌肉顏色三個重要性狀存在顯著差異(P<0.05)；WNT10B基因Cfr42I-RFL

7、P位點與腿臀肉骨率存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05),眼肌面積達到極顯著水平(P<0.01)。②PECI基因PvuⅡ-RFLP位點的CT基因型個體與TT基因型個體肌肉顏色差異極顯著(P<0.01)；CC基因型個體與TT基因型個體臀部背膘厚差異極顯著(P<0.01),在三點平均背膘厚和肌肉顏色差異顯著(P<0.05);CC基因型個體與CT基因型個體三點平均背膘厚差異顯著(P<0.05)。③WNT10B基因Cfr42I-RFLP位點的CT基因型個