豬脂肪沉積候選基因PTP-1B和AQP7的分離和初步研究.pdf

1、本文根據(jù)國(guó)內(nèi)外QTL報(bào)道、豬-人比較圖譜和基因的生理生化功能三方面信息選取兩個(gè)基因PTP-1B和AQP7作為豬脂肪沉積候選基因，利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法對(duì)兩個(gè)基因序列進(jìn)行分離和測(cè)序，分析了候選基因的多態(tài)性位點(diǎn)與豬重要經(jīng)濟(jì)性狀尤其是脂肪沉積性狀的相關(guān)性及其遺傳效應(yīng)，以及使用Real-time PCR方法研究了PTP-1B和AQPP7兩個(gè)基因在豬不同組織中的表達(dá)。獲得的主要結(jié)論如下： 一、豬PTP-1B基因的分離、測(cè)序和性狀

2、關(guān)聯(lián)分析。 以人PTP-1B基因序列作為探針，在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)得到豬EST)芋列并進(jìn)行拼接。根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出了部分5’端非編碼區(qū)序列、全部編碼區(qū)序列和部分3’端非編碼區(qū)序列。通過(guò)外顯子設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出了6、7、8、9內(nèi)含子序列。內(nèi)含子剪接位點(diǎn)序列符合GT/AG法則。用Clustalw工具比對(duì)大白、長(zhǎng)白和梅山序列發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)很保守沒(méi)有任何突變，在內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)有14處SNPs，在3’端有3處SNPs。取第7內(nèi)含

3、子一導(dǎo)致Eco88I酶切位點(diǎn)進(jìn)行與脂肪沉積性狀關(guān)聯(lián)性分析，建立了該突變位點(diǎn)的PCR-Ec088I-RFLP分型方法，在梅山、大白和“大白×梅山”F2代資源家系中的研究表明： 1. 在21頭長(zhǎng)白、16頭大白和22頭梅山個(gè)體中，大白和長(zhǎng)白只有單一的G等位基因，而中國(guó)本地豬種梅山以雜合子GA基因型為主，因此西方豬種和中國(guó)本地豬種此位點(diǎn)有一定差異。 2. 本研究213頭“大白×梅山”F2代資源家系用于性狀關(guān)聯(lián)分析。在此位點(diǎn)，AA

4、、AG和GG基因型數(shù)目分別為133、69和11個(gè)。PTP-1B基因多態(tài)性與板油重、內(nèi)脂率呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，與胸腰椎間背膘厚呈顯著相關(guān)(P<0.05)。且雜合子AG基因型個(gè)體的板油重和內(nèi)酯率都呈最低，胸腰椎間背膘厚GG基因型最低。 二、豬AQP7基因的分離、測(cè)序和性狀關(guān)聯(lián)分析。 以人AQP7基因序列作為探針，在NCBI的：EST數(shù)據(jù)庫(kù)中得到一段豬cDNA文庫(kù)中的序列，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出豬AQP7基因部分c

5、DNA序列，并以此cDNA序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出豬AQP7基因1、4、5、6內(nèi)含子，在內(nèi)含子1中發(fā)現(xiàn)有4處SNPs，內(nèi)含子4中發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNPs，其一位點(diǎn)導(dǎo)致PstI酶切。以第4內(nèi)含子(A-G)多態(tài)位點(diǎn)建立該位點(diǎn)的PCR-estI-RFLP分型方法，在梅山、大白和“大白×梅山”F2代資源家系中的研究表明： 1. 在24頭梅山、21頭大白和18頭長(zhǎng)白個(gè)體中，大白和長(zhǎng)白以GG基因型為主，伴隨少量的AG型，其中大白G％97.60％，A％為2

6、.40％，長(zhǎng)白G％為91.65％，A％為8.35％，而梅山G％33.35％，A％為66.65％，由此可以看出在本研究群體中，等位基因A， B在以梅山和大白、長(zhǎng)白為代表的中外豬種中存在明顯差異。 2．用234頭“大白×梅山”F2代資源家系進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)與豬板油重、內(nèi)脂率、背膘厚、肥肉率和瘦肥比率等脂肪沉積性狀顯著相關(guān)，且GG基因型個(gè)體脂肪沉積性狀值比AA基因型個(gè)體低，提高G等位基因頻率可顯著減少脂肪沉積。根據(jù)RE

7、G(SAS8.0)程序分析，該位點(diǎn)以加性遺傳效應(yīng)為主，花油重、6-7腰椎間背膘厚、肥肉率加性效應(yīng)極顯著(P<0.01)。 三、Real-time PCR。 利用Real-time PCR技術(shù)分析了PTP-1B和AQP7基因在4月齡大白豬的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、小腸、卵巢、脂肪幾種組織中的表達(dá)情況。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PTP-1B基因在所檢測(cè)的8種組織中廣泛表達(dá)，在肺中表達(dá)量最高，其次是小腸和脂肪，表達(dá)量最低的是心臟和