水牛、豬GCNF和SF-1基因克隆與表達規(guī)律的初步研究.pdf

1、生殖細胞核受體(Germ cell nuclear factor，GCNF)和類固醇生成因子（Steroidogenic factor1，SF-1）是核受體超家族中的孤兒核受體成員，它們在胚胎發(fā)育、性腺分化、內(nèi)分泌及生殖調(diào)控等多個方面發(fā)揮十分重要的作用。本研究以本地沼澤型水牛和家豬為研究對象，應用RT-PCR的方法克隆GCNF和SF-1基因的編碼區(qū)序列，通過qRT-PCR技術分析GCNF和SF-1在不同組織的表達，并應用免疫組化技術對其

2、蛋白在卵巢和睪丸組織的定位進行分析。此外還應用qRT-PCR系統(tǒng)地研究了GCNF和SF-1基因在卵泡發(fā)生和早期胚胎發(fā)育過程中的表達規(guī)律，并從甲基化和miRNA兩個層面對其基因表達調(diào)控的分子機制進行了探討。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.GCNF和SF-1基因全長編碼區(qū)序列片段的克隆。測序結(jié)果顯示水牛和豬GCNF基因包含全長編碼區(qū)片段大小分別為1391 bp和1572 bp，分別編碼435和450個氨基酸殘基。多重序列比較結(jié)果顯示，

3、水牛GCNF基因氨基酸序列與豬、羊、小鼠、人和黑猩猩的相似性分別為97％、97％、97％、96％和97％。水牛和豬SF-1基因包含全長編碼序列的擴增片段大小分別為1490bp和2002bp，均編碼461個氨基酸殘基。多重序列比較結(jié)果顯示，水牛SF-1基因氨基酸與豬、羊、小鼠、人和黑猩猩的相似性分別為96％、98％、94％、94％和95％。在氨基酸和核苷酸水平上GCNF和SF-1基因在不同物種中具有較高保守性。蛋白二級結(jié)構分析結(jié)果顯示GC

4、NF和SF-1蛋白主要以β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲為主，其次是α-螺旋，β-折疊較少，兩種蛋白均含有鋅指結(jié)構和配體結(jié)合域結(jié)構，具備結(jié)合DNA特征的典型核受體結(jié)構。
　　 2.不同組織基因表達譜構建及在性腺組織中的定位。應用qRT-PCR技術，檢測了GCNF和SF-1基因在水牛不同組織的表達。結(jié)果顯示，水牛 GCNF基因在睪丸(相對表達量為24.9±0.02)和卵巢(24.1±0.16)組織表達水平較高，顯著高過在皮膚(1.0±0.29

5、)、腎臟(0.77±0.11)、大腦(0.48±0.26)、肝(0.46±0.02)、生殖嵴(0.45±0.02)、肌肉(0.43±0.01)、骨骼(0.31±0.26)和垂體(0.25±0.01)等組織的表達。水牛SF-1在睪丸(17.8±0.16)、卵巢(12.1±0.03)及生殖嵴中(7.7±0.02)表達水平較高，在大腦(3.1±0.01)、肝臟(1.8±0.12)、皮膚(1.8±0.11)和垂體(1.0±0.3)有一定的表達，

6、而腎臟(0.79±0.68)、骨骼(0.65±0.03)和肌肉(0.58±0.18)等組織表達量均較低。免疫組化結(jié)果顯示GCNF基因在卵巢中原始卵泡和初級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞中均呈強陽性且主要在細胞核中表達，在次級卵泡和有腔卵泡中，卵泡膜細胞和壁顆粒細胞呈強陽性，而卵丘細胞和卵母細胞呈弱陽性;SF-1基因在原始卵泡的卵母細胞核中呈強陽性染色，在初級和次級卵泡中的顆粒細胞和卵母細胞中均呈強陽性，在有腔卵泡中，卵丘細胞呈強陽性染色，而在

7、卵母細胞中表達量較弱。在睪丸組織中，GCNF和SF-1蛋白均存在于曲細精管生精上皮的生精細胞中，推測GCNF和SF-1在卵泡發(fā)生和精子發(fā)生過程中起著重要的作用。
　　 3.卵母細胞成熟前后和早期胚胎中的表達譜研究。應用Cells to cDNA和qRT-PCR的方法檢測了卵母細胞成熟前后GCNF和SF-1的表達水平，結(jié)果顯示GCNF、SF-1在水牛和豬COCs成熟過程中持續(xù)有表達，并且在成熟后的表達量較成熟前明顯下調(diào)。在早期胚胎

8、發(fā)生過程中，GCNF在2cell時期表達最高（相對表達量為1±0.03），隨后表達量先降低后緩慢回升，桑椹胚至囊胚期表達突然下降至幾乎檢測不到表達(0.01±0.04)。SF-1在2cell到8cell期表達量基本無明顯變化，8cell到桑椹胚期表達量極顯著上升至峰值(6.89±0.35)，到囊胚期表達量又驟然下降至幾乎沒有表達(0.001±0.3)。應用亞硫酸鹽甲基化修飾測序檢測了GCNF和SF-15'調(diào)控區(qū)域CpG島甲基化水平，結(jié)果

9、顯示GCNF在COCs成熟前甲基化程度要低于成熟后(48.8％ vs87.8％);而SF-1在COCs成熟前后甲基化程度無明顯變化(3.2％vs3.2％)。
　　 4.探討miRNA參與GCNF和SF-1基因表達調(diào)控的機制。通過3'RACE技術成功克隆了豬GCNF和SF-1的3'UTR序列，長度分別為1816 bp和893 bp。應用Microinspector軟件預測篩選發(fā)現(xiàn)ssc-miR-181a和ssc-miR-615在G