轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆水牛與廣西水牛的遺傳特性研究.pdf

1、廣西大學(xué)博士學(xué)位論文轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆水牛與廣西水牛的遺傳特性研究姓名：崔奎青申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖指導(dǎo)教師：石德順20070701穿孔能獲得更多的轉(zhuǎn)基因抗性細(xì)胞集落，轉(zhuǎn)染DNA的純度和細(xì)胞的狀態(tài)也明顯影晌脂質(zhì)體法的轉(zhuǎn)染效率。用含有GFP基因的線性化載體pCEEGFPIRESNeodNdB通過lipofectaminermooo轉(zhuǎn)染水牛nfl)L成纖維細(xì)胞，(3418篩選2周后挑取抗性細(xì)胞集落擴(kuò)大培養(yǎng)，對轉(zhuǎn)染外源基因的

2、抗性細(xì)胞系的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過G418篩選后細(xì)胞增殖活力下降，細(xì)胞爬片liE染色后可看到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，凋亡分析發(fā)現(xiàn)部分抗性細(xì)胞表現(xiàn)出早期凋亡征狀，但染色體核型正常率與正常組相比差異不明顯。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染本身或隨后的篩選過程會對細(xì)胞造成一定的損害。從綿羊基因組擴(kuò)增得到Bcasein基因啟動子區(qū)到第二內(nèi)含子區(qū)41kb的5’調(diào)控序列，從人基因組克隆得到人血小板生成素(TP0)基因長55kb的基因組序列，然后將啟動子和

3、TPO定向插入到ploxp骨架上。包含CMV超級啟動子的GFP片段從質(zhì)粒pCEEGFPIRESNeodNdB中獲得，并定向連接到ploxpCNTPO中。經(jīng)酶切、PCR鑒定，成功獲得了包含人TPO基因、綿羊13casein啟動子、GFP標(biāo)記基因和新霉素抗性基因等長達(dá)20kb的轉(zhuǎn)基因載體ploxpEGFPCNTPO。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將構(gòu)建好的載體線性化后導(dǎo)入水牛胎兒成纖維細(xì)胞中，G418篩選后得到35個抗性細(xì)胞集落，擴(kuò)大培養(yǎng)后其中4個表達(dá)GF

4、P綠色熒光。經(jīng)PCR鑒定目的基因整合的完整性，發(fā)現(xiàn)1個為完整轉(zhuǎn)EGFPCNTPO基因陽性細(xì)胞集落。通過顯微操作、電融合的方法將陽性細(xì)胞移入體外成熟去核的水牛卵母細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建重組胚，囊胚率顯著低于對照組(P005)，說明供體細(xì)胞經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染及長期體外培養(yǎng)篩選對克隆胚胎的早期發(fā)育有明顯影響；對轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞構(gòu)建核移植重組胚外源基因表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白開始表達(dá)于4細(xì)胞以后的重組胚，說明轉(zhuǎn)染的外源基因能夠在胚胎早期發(fā)育過程中表達(dá)。為研究廣