水牛卵泡抑素（Follistatin）基因cDNA克隆及真核表達.pdf

1、卵泡抑素(Follistatin，F(xiàn)S)具有廣泛的生物學(xué)功能，特別是對動物的生殖活動和肌肉生長調(diào)節(jié)方面。關(guān)于FS生物學(xué)功能的研究，國內(nèi)外已有相關(guān)的報道，但關(guān)于水牛Fs(bFS)的研究卻未見報道。本研究填補了這一空白，為闡明水牛的繁殖機制、提高水牛的繁殖性能奠定基礎(chǔ)。 目前由于國內(nèi)外還沒有bFS基因cDNA序列的克隆，本研究基于FS基因具有高度保守性的特點，根據(jù)GeneBank登錄的奶牛的FS基因cDNA序列，設(shè)計了一對特異性的引

2、物，并在引物兩端加上相應(yīng)的酶切位點和保護堿基，在起始密碼加了ACC Kozak序列，為后續(xù)真核表達打下基礎(chǔ)。抽提水牛卵巢組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，獲得目的基因，將目的基因亞克隆到pMD-18載體，測序。測序結(jié)果在NOBl上進行Blast，顯示本試驗成功獲得了bFS基因cDNA全序列，序列全長1035bp。同源性比較分析顯示，本試驗獲得的bFS cDNA序列與奶牛、馬、人和豬的同源性分別為

3、98.8％、94.0％、91.7％、93.3％：與奶牛FS cDNA序列相比，有12處堿基發(fā)生了變化，其中+389位和+469位兩處堿基的變化，造成氨基酸的改變。 利用試驗一獲得的bFS cDNA序列，通過酶切-連接-轉(zhuǎn)化-篩選-鑒定-測序等步驟，確認成功構(gòu)建了真核表達載體pEGFP-bFS，全長5.7kb。用陽離子脂質(zhì)體法，將pEGFP-bFS轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的水牛成纖維細胞和BHK細胞系，經(jīng)過48h培養(yǎng)后，在相差熒光顯微鏡下觀察