水牛垂體催乳素（PRL）cDNA的克隆與原核表達(dá).pdf

1、本論文研究?jī)?nèi)容是水牛垂體催乳素cDNA的克隆與原核表達(dá)。論文第一部分包括第一章，為文獻(xiàn)綜述部分；第二部分包括第二章和第三章，為試驗(yàn)部分。 水牛是我國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物物種，有乳質(zhì)好和耐粗飼等優(yōu)點(diǎn)，不足的是其繁殖力和泌乳能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于奶牛。催乳素是一種由垂體前葉分泌的多肽類(lèi)激素，對(duì)催乳素的研究表明，它可以提高繁殖力和促進(jìn)泌乳。本試驗(yàn)的目的，就是通過(guò)催乳素基因cDNA的克隆與原核表達(dá)，對(duì)催乳素基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行初步探索和揭示，為提高

2、水牛的繁殖力和泌乳能力打下理論基礎(chǔ)。 論文第二章的研究?jī)?nèi)容是水牛垂體催乳素基因的cDNA克隆和序列分析。根據(jù)幾種哺乳動(dòng)物催乳素基因cDNA序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，從水牛腦垂體中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增水牛催乳素基因cDNA序列，并重組到pMD18-T載體，對(duì)PCR和雙酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定結(jié)果表明：該cDNA序列開(kāi)放閱讀框(ORF)，長(zhǎng)度為690bp，推測(cè)編碼氨基酸為229個(gè)，其中前19個(gè)氨

3、基酸為信號(hào)肽。用NCBI上的BLAST功能將測(cè)序結(jié)果同GenBank上已發(fā)表的哺乳動(dòng)物PRL序列進(jìn)行比對(duì)，呈現(xiàn)高度的進(jìn)化保守性，與牛屬動(dòng)物同源性高達(dá)98.4％，證明所克隆的序列為水牛催乳素基因的cDNA序列。該基因序列已提交到GenBank(登錄號(hào)：EF054878)。本試驗(yàn)首次成功擴(kuò)增了水牛催乳素cDNA序列，該序列涵蓋了水牛催乳素cDNA的全部ORF區(qū)，為進(jìn)一步研究水牛的催乳素基因原核表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。 論文的第三章研究?jī)?nèi)容是

4、水牛催乳素基因的原核表達(dá)，在得到的水牛催乳素基因cDNA序列的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增去除信號(hào)肽序列的催乳素基因目的片段，然后將該目的片段與高效表達(dá)載體pOE-30同時(shí)進(jìn)行BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，成功構(gòu)建了體外表達(dá)催乳素蛋白的原核表達(dá)載體pQE-30-PRL。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定其連接方向的正確性，將鑒定為陽(yáng)性的重組表達(dá)載體pQE-30-PRL轉(zhuǎn)化