南方鲇PRL-cDNA克隆、組織分布和原核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、2006年3月至2008年3月，用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了南方鲇催乳素(PRL)的cDNA全長(zhǎng)序列，并通過(guò)RT-PCR方法研究了南方鲇PRL的組織分布，同時(shí)成功構(gòu)建了南方鲇pET-28-PRL重組質(zhì)粒。 南方鲇PRL-cDNA全長(zhǎng)1235bp，包括90bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)，639bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)即開(kāi)放閱讀框(ORF)和506bp的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)，真核生物保守的AATAAA加尾信號(hào)位于Poly(

2、A)上游22bp，多聚腺苷酸(PolyA)尾巴由17腺苷酸(A)組成。開(kāi)放閱讀框編碼由212個(gè)氨基酸殘基組成的PRL前體，經(jīng)Iformax 2003軟件包的Vector NTI suite 9程序預(yù)測(cè)其分子量約為23kDa，等電點(diǎn)(PI)為8.19。SignalP預(yù)測(cè)該P(yáng)RL前體包括由26個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽和186個(gè)氨基酸殘基組成的成熟肽，成熟肽含有4個(gè)半胱氨酸殘基組成兩個(gè)二硫鍵，當(dāng)PRL前體合成后，通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)出膜，信號(hào)肽被酶切

3、后釋放出PRL的成熟分子。 南方鲇PRL推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分析發(fā)現(xiàn)：南方鲇PRL與印度囊鰓鲇和斑點(diǎn)叉尾鮰的PRL的相似性分別為89.2％和91.5％，與其他硬骨魚類PRL的相似性為51.0％-77.6％，與兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類PRL的相似性為27.9％-31.6％，與人類PRL的相似性為29.1％。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，本研究克隆的南方鲇PRL和鲇形目魚類已經(jīng)克隆的印度囊鰓鲇和斑點(diǎn)叉尾鮰的PRL基因聚在一起，構(gòu)成一個(gè)單系

4、群，這與預(yù)期結(jié)果一致。 RT-PCR研究南方鲇PRL在各部腦、消化道各段、肝臟、胰腺、脾臟、腎、性腺、心臟，以及皮膚、肌肉、垂體等20種組織表達(dá)的結(jié)果表明，PRL在垂體表達(dá)量最高，其次為精巢、卵巢、端腦、間腦、中腦、小腦、延腦和嗅囊，肝臟、胰臟、腎、肌肉、心臟PRL低量表達(dá)，胃賁門部、胃體、胃幽門部和腸的前、中、后各段均無(wú)PRL的表達(dá)。與已有工作不同的是，研究南方鲇PRL基因的組織分布時(shí)擴(kuò)大了取材范圍，并對(duì)各器官作了更細(xì)致的區(qū)分

5、，在此基礎(chǔ)上首次發(fā)現(xiàn)PRL基因在嗅囊表達(dá)。PRL基因在嗅囊中表達(dá)暗示PRL可能具有至今尚未被發(fā)現(xiàn)的新的功能，這為目前PRL功能研究這一熱點(diǎn)問(wèn)題提供了新的線索。 本研究在得到南方鲇PRL-cDNA序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)TA克隆測(cè)序證明為編碼南方鲇PRL成熟肽的目的序列。將TA克隆構(gòu)建的重組質(zhì)粒與表達(dá)載體pET-28同時(shí)雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞