六種經(jīng)濟魚類生長激素基因cDNA的克隆和原核表達.pdf

1、根據(jù)鯉形目和鲇形目生長激素(Growthhormone，GH)基因N-末端和C-末端堿基序列的保守性設(shè)計一對簡并引物；從腦垂體中提取總RNA，用RT-PCR方法擴增并克隆到了大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)、鲇魚(Silurusasotus)、黃河鯉(CyprinuscarpioinHuangher

2、iver)和淇河鯽(CarassiusauratusinQiheriver)6種重要經(jīng)濟魚類的GH基因cDNA，并詳細分析了其序列特征。序列同源性檢索表明，所克隆的cDNA片段為這6種魚的GH基因，其GenBank注冊號分別為DQ350432、DQ350433、DQ350434、DQ350435、DQ350436和DQ350437。其中大鱗副泥鰍和胭脂魚的GH基因序列系第一次克隆。分析其核苷酸序列和推測的氨基酸序列，結(jié)果顯示：本研究克隆

3、到的鲇魚生長激素基因的開放閱讀框(ORF)包括603個核苷酸，編碼200個氨基酸，其中包括22個氨基酸的信號肽和178個氨基酸的成熟肽；其它五種魚的ORF均為633bp，編碼210個氨基酸，其中包括22個氨基酸的信號肽和188個氨基酸的成熟肽；泥鰍和大鱗副泥鰍成熟肽氨基酸序列的同源性為100％。這6個蛋白成熟肽序列和其它已知的魚類GH都有較高的同源性，特別是與相同目的魚類序列相比，但與高等脊椎動物GH的同源性較低。通過比對，在這些蛋白序

4、列內(nèi)鑒定了許多保守的氨基酸殘基，其中的大多數(shù)聚集而成5個保守域?；谶@6種魚類與其它魚類和高等脊椎動物的GH成熟肽氨基酸序列進行分子系統(tǒng)學(xué)分析，結(jié)果(MP樹和NJ樹)與根據(jù)形態(tài)特征重建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致。 用6種魚的特異引物(上游引物加入NdeⅠ酶切位點，下游引物加入XhoⅠ酶切位點)分別擴增了大鱗副泥鰍、鲇魚、胭脂魚、黃河鯉和淇河鯽的GH成熟肽，將其定向插入到融合表達載體pET-28a質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，

5、用質(zhì)粒PCR方法篩選陽性克隆，用NdeⅠ和XhoⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒。以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達，SDS-PAGE分析表明誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達了融合蛋白，主要為不溶性的包含體，鲇魚分子量約為22.5kD,其它4種約為23.5kD，與實驗預(yù)期的分子量一致。5種融合蛋白表達量均超過蛋白總量的50％。融合蛋白N-末端帶有組氨酸標簽，采用固定化金屬配體親和層析，獲得電泳純的重組蛋白。 本研究克隆到了6種魚的GH基因cDNA序列，并成功構(gòu)建了原