Sox2基因?qū)d羊體細(xì)胞克隆不同供體細(xì)胞表觀遺傳修飾的影響.pdf

1、分類號 TP391.41 學(xué)校代碼 10129 U D C 35.140 學(xué) 號 2013211016 Sox2 基因?qū)d羊體細(xì)胞克隆不同供體細(xì)胞表觀遺傳修飾的影響 Effect of Sox2 Gene on the Epigenetic Modification of Different Don

2、or Cells in Sheep Somatic Cell Nuclear Transfer 申 請 人： 劉懷禹 學(xué)生類別： 學(xué)術(shù)型碩士 學(xué)科門類： 理 學(xué) 學(xué)科專業(yè)： 發(fā)育生物學(xué) 研究方向： 動物遺傳與發(fā)育 指導(dǎo)教師： 張焱如 教授 論文提交日期：二〇一六年六月 摘 要 哺乳動物體細(xì)胞克隆技術(shù)自誕生以來，發(fā)展迅速且日益趨于成熟，但體細(xì)胞克隆效率低始終是制約其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用與發(fā)展的瓶頸。核不完全重編程及供體細(xì)胞的類型與克

3、隆效率密切相關(guān)。表觀遺傳修飾中 DNA 甲基化、組蛋白乙酰化是影響核重編程的關(guān)鍵因素。 研究證實， sox2 基因?qū)S持細(xì)胞多能性及胚胎著床后的發(fā)育起關(guān)鍵的作用，以高表達(dá) sox2 基因的神經(jīng)干細(xì)胞為核供體進(jìn)行核移植時具有較高的克隆效率。 為此，本研究以內(nèi)蒙古地區(qū)優(yōu)勢畜種綿羊為實驗對象，選擇綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, BMSCs） 、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Ad

4、ipose-derived Stromal Cells ,ADSCs）和皮膚成纖維細(xì)胞 （Sheep Epidermal Fibroblast Cells ,SEFCs）為核供體，經(jīng)電轉(zhuǎn)染將 sox2 基因?qū)?BMSCs 和 ADSCs 和SEFCs，檢測 sox2 基因?qū)θ惡斯w細(xì)胞 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1（DNA Methyltransferase 1,DNMT1）和組蛋白去乙?；?2（Histone Deacetyl

5、ase 2,HDAC2）基因的表達(dá)水平，分析了 sox2 基因?qū)θ惡斯w細(xì)胞表觀遺傳修飾的影響。同時以導(dǎo)入 sox2 基因的BMSCs 為核供體構(gòu)建重構(gòu)胚， 以 SEFCs 核供體構(gòu)建的重構(gòu)胚為對照， 分析了 sox2 基因?qū)χ貥?gòu)胚表觀遺傳修飾及發(fā)育能力的影響。主要研究結(jié)果如下： （1） 分離得到了綿羊 BMSCs、 ADSCs 和 SEFCs 細(xì)胞系， 三類細(xì)胞生長曲線均呈 “S”型；經(jīng) RT-PCR 檢測，BMSCs 和 ADS

6、Cs 均表達(dá)了干細(xì)胞特異因子 Sox2、Oct4 和 Nanog基因。 （2）構(gòu)建了 pEGFPS-N1-Sox2 真核表達(dá)載體，對 BMSCs、ADSCs 和 SEFCs 三類細(xì)胞進(jìn)行了電轉(zhuǎn)染，經(jīng)篩選得到過表達(dá) sox2 基因細(xì)胞株，經(jīng)實時定量 PCR 檢測，三種過表達(dá)sox2基因細(xì)胞株中的DNMT1和HDAC2 基因表達(dá)量表現(xiàn)出不同程度的下降， DNMT1分別下降多少 68%、25%、43%；HDAC2 下降了 15%左右。 （3）

7、以過表達(dá) sox2 基因 BMSCs 為核供體，構(gòu)建重構(gòu)胚 159 個，以 SEFCs 為核供體構(gòu)建重構(gòu)胚 182 個。檢測兩類重構(gòu)胚中 DNMT1 和 HDAC2 的表達(dá)量，過表達(dá) sox2 基因 BMSCs 為供體的克隆胚比以 SEFCs 構(gòu)建的克隆胚中 DNMT1 和 HDAC2 的表達(dá)量低 50%左右，由此推測 sox2 基因的過表達(dá)可能有利于克隆胚核的重編程，進(jìn)而促進(jìn)重構(gòu)胚的發(fā)育。 以上結(jié)果對闡明 sox2 基因影響不同核供體