黑熊體細(xì)胞培養(yǎng)及熊-牛體細(xì)胞克隆胚胎融合條件初探.pdf

1、熊的膽、肉、骨、皮等均可入藥。因此黑熊除具有觀賞價(jià)值外，還有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也正是因?yàn)樗哂休^高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，導(dǎo)致種群數(shù)量急劇下降。已經(jīng)被列為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的二類野生動(dòng)物。
　　亞洲黑熊(Ursus thibetanus)，別名狗熊、黑瞎子，東北地區(qū)分布在黑龍江、沈陽(yáng)、吉林的長(zhǎng)白山，分類地位動(dòng)物界→脊索動(dòng)物門(mén)→哺乳綱→真獸亞綱→食肉目→熊科→黑熊。近年來(lái)亂砍濫伐日益嚴(yán)重，曾經(jīng)分布很廣的熊類棲息地變成孤立的小區(qū)，導(dǎo)致種群的分離，尤其長(zhǎng)白

2、山地區(qū)棲息地消失最嚴(yán)重，亞洲黑熊基因和種質(zhì)保種迫在眉睫。
　　本研究分為兩個(gè)部分：第一部分為組織塊法和酶法結(jié)合建立黑熊耳部成纖維細(xì)胞系。包括原代培養(yǎng)，細(xì)胞純化，傳代培養(yǎng)液的選擇，生長(zhǎng)曲線的繪制等。
　　第二部分為以亞洲黑熊成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞，以延邊黃牛MII期去核的卵母細(xì)胞作為受體，以擠壓法去核，注入體細(xì)胞到卵黃周隙中，采用不同的融合電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖次數(shù)、脈沖時(shí)程對(duì)熊-?？寺∨咛ミM(jìn)行融合，復(fù)合化學(xué)方法激活。結(jié)果以融合率、卵

3、裂率、4-細(xì)胞發(fā)育率、8-細(xì)胞發(fā)育率、16-細(xì)胞發(fā)育率和囊胚發(fā)育率計(jì)。結(jié)果如下：
　　1.通過(guò)組織塊法+酶法培養(yǎng)，成功獲得亞洲黑熊成纖維細(xì)胞系。
　　2.對(duì)純化后的第三代成纖維細(xì)胞進(jìn)行群體倍增實(shí)驗(yàn)，根據(jù)前后細(xì)胞密度的變化，通過(guò)計(jì)算，結(jié)果確定適合黑熊成纖維細(xì)胞系傳代的培養(yǎng)液血清濃度為10％.
　　3.通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線研究了黑熊耳皮膚成纖維細(xì)胞的增殖規(guī)律，用 DMEM培養(yǎng)黑熊耳部成纖維細(xì)胞，傳代后滯留期較短，約有一天左右，

4、活細(xì)胞逐漸貼壁生長(zhǎng)。此后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，延續(xù)六天左右。第八天細(xì)胞發(fā)生接觸抑制而開(kāi)始死亡，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)入平臺(tái)期，維持三天左右，細(xì)胞逐漸脫落死亡，細(xì)胞數(shù)量有所下降；
　　4.使用1100 v／cm的融合電場(chǎng)后，16-細(xì)胞發(fā)育率為34.89%顯著高于其他三組（P<0.05）。
　　5.使用2次融合脈沖后，8-細(xì)胞發(fā)育率61.31%顯著高于其他兩組（P<0.05）。
　　6.脈沖時(shí)程為40μs時(shí)，4-細(xì)胞發(fā)育率75%顯著高于10