延邊黃牛體細(xì)胞克隆融合、激活條件的研究.pdf

1、面對(duì)愈來(lái)愈激烈的國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)形勢(shì)，我國(guó)牛的品種還基本處于役用型或役肉兼用型和役乳兼用型的現(xiàn)狀，這就決定了我國(guó)的牛產(chǎn)品很難在國(guó)際舞臺(tái)上占有一席之地。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，人們?cè)絹?lái)越感受到改良我國(guó)現(xiàn)有牛品種的迫切性，于是人們將視線轉(zhuǎn)移到作為選種選育的一項(xiàng)高效新興技術(shù)——體細(xì)胞克隆技術(shù)上來(lái)。 延邊黃牛作為我國(guó)五大地方良種牛之一，具有不可多得的肉用品質(zhì)，極具國(guó)際市場(chǎng)潛力，近年來(lái)它的保種選育工作要求越來(lái)越大的科技投入，為了加快其改良進(jìn)程，提高

2、選種選育效率，我們引入了體細(xì)胞克隆技術(shù)，為了這項(xiàng)工作的順利開(kāi)展，對(duì)其技術(shù)路線中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)一融合、激活作預(yù)先一步的研究，從而保障該技術(shù)在延邊黃牛保種選育工作中的成功應(yīng)用。 本研究以新鮮的顆粒細(xì)胞作為供核細(xì)胞，以延邊黃牛M Ⅱ期去核的卵母細(xì)胞作為受體，以擠壓法去核，注入供體顆粒細(xì)胞到卵黃周隙中，甘露醇融合液中施加20gs時(shí)長(zhǎng)的電脈沖刺激使之融合，復(fù)合化學(xué)方法激活，從融合前恢復(fù)時(shí)間、融合電場(chǎng)強(qiáng)度、甘露醇濃度、激活前恢復(fù)時(shí)間、激活方式和

3、激活時(shí)間等六個(gè)方面著手研究了適宜延邊黃牛體細(xì)胞克隆的融合、激活條件，結(jié)果以融合率、卵裂率、異常率、4-6細(xì)胞發(fā)育率和8-16細(xì)胞發(fā)育率計(jì)。結(jié)果如下： (1)2.0h的融合前恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間能夠顯著提高融合的效率及質(zhì)量，融合率和異常率分別為80.8％和16.6％。 (2)使用1100V/cm的融合電場(chǎng)強(qiáng)度后，4-6細(xì)胞和8-16細(xì)胞的發(fā)育率分別為61.9％，32.3％，顯著高于其它三組(P<0.05)。 (3)0.25

4、M、0.27M、0.30M的甘露醇濃度在融合率、卵裂率、異常率及重組胚發(fā)育率方面均不存在差異。 (4)激活前恢復(fù)培養(yǎng)20min和25min，重組胚的卵裂率為67.6％和71.6％，異常率為33.6％和29.3％，是延邊黃牛體細(xì)胞克隆理想的激活前恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間。 (5)采用離子霉素+6-DMAP的激活方式，重組胚卵裂率和8-16細(xì)胞發(fā)育率與其它三種方式?jīng)]有差異，異常率和2-4細(xì)胞發(fā)育率分別為26.6％和60.7％。

5、(6)激活培養(yǎng)4h，重組胚8-16細(xì)胞發(fā)育率為39.8％，顯著高于3h、6h組(P<0.05)，是延邊黃牛體細(xì)胞克隆的最適合激活時(shí)間。 使用SPSS14.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析并多重比較后，綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方便操作時(shí)間與過(guò)程，得出以下結(jié)論：融合前恢復(fù)培養(yǎng)2h，采用0.30mol/L甘露醇作為融合液，在1100V/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度下進(jìn)行融合是適宜延邊黃牛體細(xì)胞克隆的融合條件；激活前恢復(fù)培養(yǎng)20-25min，使用離子霉素作為激活試