化學(xué)誘導(dǎo)去核法在延邊黃牛體細(xì)胞核移植中的應(yīng)用研究.pdf

1、試驗(yàn)?zāi)康模阂匝舆咟S牛為研究對(duì)象，尋求一種操作簡(jiǎn)單、相對(duì)無(wú)損傷、去核效率高的去核方法，從而為體細(xì)胞核移植效率的提高打下基礎(chǔ)，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
　　試驗(yàn)方法：通過(guò)對(duì)兩種不同的去核化學(xué)試劑的去核率和發(fā)育率的比較確立了脫羰秋水仙堿的可靠性和可行性。
　　試驗(yàn)結(jié)果：
　　1.在脫羰秋水仙堿的不同濃度（0μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml）去核率的比較實(shí)驗(yàn)中，0.3μg/m

2、l和0.6μg/ml兩種濃度去核率分別是61.29％和55.60%差異不顯著，0.4μg/ml和0.5μg/ml兩種濃度去核率分別是81.80%和83.33%差異不顯著，但0.3μg/ml和0.6μg/ml與0.4μg/ml和0.5μg/ml兩組之間去核率卻差異顯著（P﹤0.05），從而確定了0.4μg/ml和0.5μg/ml兩種濃度是此化學(xué)去核試劑去核率的最佳濃度，并通過(guò)對(duì)供試卵母細(xì)胞Hoechst33342染色、熒光顯微鏡的觀察，試

3、驗(yàn)結(jié)果顯示較適合延邊黃牛體細(xì)胞克隆的化學(xué)去核率最佳濃度為0.4μg/ml。
　　2.為了確定脫羰秋水仙堿的最佳的激活后時(shí)間和最佳去核作用時(shí)間，在0.4μg/ml濃度下分別進(jìn)行了p.a0min作用時(shí)間30min、60min、90min、120min和p.a30min作用時(shí)間為30min、60min、90min、120min和p.a60min作用時(shí)間為30min、60min、90min、120min和p.a90min作用時(shí)間為30mi

4、n、60min、90min、120min和p.a120min作用時(shí)間為30min、60min、90min、120min通過(guò)Hoechst33342染色、熒光顯微鏡的觀察，試驗(yàn)結(jié)果顯示延邊黃牛卵母細(xì)胞的最佳的激活后時(shí)間為90min,最佳去核作用時(shí)間為90min。
　　3.在延邊黃牛卵母細(xì)胞卵齡對(duì)去核率的影響試驗(yàn)中，在脫羰秋水仙堿濃度0.4μg/ml最佳的激活后時(shí)間90min和最佳去核作用時(shí)間90min下，分別對(duì)18～20h,20～2

5、2h,22～24h卵母細(xì)胞卵齡做了去核率比較，其中18～20h和20～22h去核率差異不顯著，與22～24h的去核率差異顯著，所以試驗(yàn)選擇20～22h的卵母細(xì)胞卵齡作為最佳試驗(yàn)卵齡。
　　4.在確定鬼臼亞乙苷的濃度試驗(yàn)中，分別對(duì)0μg/ml、25μg/ml、36μg/ml、50μg/ml、63μg/ml、75μg/ml濃度進(jìn)行了去核率的試驗(yàn)，其中0μg/ml、25μg/ml差異不顯著，25μg/ml、36μg/ml差異不顯著，36

6、μg/ml、75μg/ml差異不顯著63μg/ml、75μg/ml差異不顯著，50μg/ml去核率最高與其它各個(gè)濃度均差異顯著，所以50μg/ml濃度是延邊黃牛卵母細(xì)胞去核率的最佳濃度。
　　5.在鬼臼亞乙苷的作用時(shí)間試驗(yàn)中，對(duì)供試卵母細(xì)胞分別作用了0min時(shí)去核率為4.00%，60min時(shí)去核率為38%，90min時(shí)去核率為32.86%，120min時(shí)去核率為60.45%，150min時(shí)去核率為56.67%，180min時(shí)去核率

7、為40%,其中60min、90min、180min之間差異不顯著，120min、150min之間差異不顯著且去核率最高，從而確立了鬼臼亞乙苷的最佳作用時(shí)間為120min。
　　6.在第六個(gè)實(shí)驗(yàn)中比較了兩種化學(xué)去核試劑以及顯微操作去核方法對(duì)重構(gòu)胚發(fā)育率的影響，孤雌激活對(duì)照組囊胚發(fā)育率為37.98%，脫羰秋水仙堿的囊胚發(fā)育率為27.08%，鬼臼亞乙苷沒能發(fā)育到囊胚，顯微操作去核法囊胚發(fā)育率為17.87%，其中脫羰秋水仙堿和顯微操作去核