末期去核在延邊黃牛體細(xì)胞核移植中的應(yīng)用研究.pdf

1、【目的】通常我們利用第二次減數(shù)分裂中期（MII）的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核操作，這種方法去核是盲目的，需要借助DNA染色和熒光紫外線的照射才能完成去核，為了提高延邊黃牛體細(xì)胞核移植卵母細(xì)胞去核效率，我們采用末期（TII期）去核方法進(jìn)行卵母細(xì)胞去核操作，采用末期去核可以避免DNA染色和紫外線的照射，少量細(xì)胞質(zhì)去除等優(yōu)點(diǎn)。
　　【方法】卵母細(xì)胞體外成熟后去除卵丘顆粒細(xì)胞，經(jīng)7％乙醇處理5-7min，再培養(yǎng)2-3h，待第二極體排出后，進(jìn)行去核（

2、同時(shí)去除第一、二極體及其附近少量的細(xì)胞質(zhì)），來源于延邊黃牛耳部和腹部成纖維細(xì)胞分別采用帶下注核和胞漿內(nèi)注核方法，進(jìn)行牛體細(xì)胞核移植，MII期卵母細(xì)胞作為對照實(shí)驗(yàn)。
　　【結(jié)果】激活體外成熟28h的卵母細(xì)胞，培養(yǎng)2-3h，第二極體排出率最高，其中35%的卵母細(xì)胞中第一、二極體夾角在0-30o之間，通過 Hoechst33342DNA染色觀察，有100%的核物質(zhì)與第一、二極體相鄰，而MII期僅為67.4%；末期去核方法，去除第一、二極

3、體及其附近少量細(xì)胞質(zhì)，可達(dá)到較高的去核率，采用末期去核方法去除20%細(xì)胞質(zhì)和10%細(xì)胞質(zhì)時(shí)去核率顯著高于對照組去除30%細(xì)胞質(zhì)的MII期去核方法；末期受體胞質(zhì)構(gòu)建的重構(gòu)胚卵裂率明顯高于 MII期對照組，但是囊胚發(fā)育率3組之間不顯著；來源于牛耳部和腹部成纖維細(xì)胞，采用帶下注核可以支持囊胚發(fā)育，相反采用胞漿內(nèi)注核沒能支持囊胚發(fā)育；激活體外成熟（IVM）24h，26h，28h和30h的卵母細(xì)胞得到的末期受體胞質(zhì)所構(gòu)建的重組胚在卵裂率及囊胚發(fā)育