化學(xué)輔助去核法在延邊黃牛體細(xì)胞核移植中應(yīng)用的研究.pdf

1、【目的】為避免盲吸法去核造成的大量胞質(zhì)流失，DNA染色和紫外線照射對卵母細(xì)胞造成的傷害，本研究使用化學(xué)誘導(dǎo)劑脫羰秋水仙堿(Demecolcine，簡稱Deme)對延邊黃牛卵母細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)輔助去核，旨在為延邊黃牛核移植建立一套操作簡便，對卵母細(xì)胞損傷少，高效穩(wěn)定的去核方法，為進(jìn)一步提高延邊黃牛核移植效率打下良好的基礎(chǔ)。
　　【方法】將體外成熟至中期和末期延邊黃牛卵母細(xì)胞分別使用濃度為0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/m

2、L的Deme在分別為30min、45min、60min的不同時長下處理，顯微操作去除牛卵母細(xì)胞核,并將去核的卵母細(xì)胞作為受體，構(gòu)建重構(gòu)胚并觀察發(fā)育情況；在不同時期添加6－二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)，觀察其對末期卵母細(xì)胞核移植的影響；比較不同成熟時期的受體細(xì)胞質(zhì)對延邊黃牛卵母細(xì)胞體細(xì)胞克隆卵裂率以及囊胚發(fā)育率的影響。
　　【結(jié)果】1）體外成熟22h的卵母細(xì)胞在0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL的Deme溶液中處

3、理45min，顯核率與去核率無顯著差異，去核率達(dá)100％，但是0.2μg/mL處理組的囊胚發(fā)育率顯著高于其他處理組；45min處理組的顯核率顯著高于30min、60min處理組，45min處理組的囊胚發(fā)育率率高于其他處理組；化學(xué)輔助去核法的囊胚發(fā)育率顯著高于盲吸法。
　　2）體外成熟28h后激活的卵母細(xì)胞在0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL的Deme溶液中處理45min，顯核率與去核率無顯著差異，去核率達(dá)100%

4、，但是0.3μg/mL處理組的囊胚發(fā)育率顯著高于其他處理組；45min處理組的顯核率顯著高于30min、60min處理組，45min處理組的囊胚發(fā)育率高于其他處理組；化學(xué)輔助末期去核法的囊胚發(fā)育率顯著高于盲吸法。
　　3）體外成熟的老化卵母細(xì)胞，使用離子霉素單獨處理后91%被激活,而在離子霉素聯(lián)合添加6-DMAP處理后卻沒有細(xì)胞被激活，也就是沒有第二極體的排出.另外,融合后使用6-DMAP處理，所得重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率最低，而激活后

5、的卵母細(xì)胞立即用6-DMAP處理，所得重構(gòu)胚的發(fā)育能力與無6-DMAP處理的相近。
　　4）MII期卵母細(xì)胞的顯核率與TII期卵母細(xì)胞的顯核率無顯著差異；但是TII期卵母細(xì)胞所得重構(gòu)胚的卵裂率及囊胚發(fā)育率均顯著高于 MII期卵母細(xì)胞所得重構(gòu)胚的卵裂率及囊胚發(fā)育率。
　　【結(jié)論】將Deme的使用濃度降低至0.2μg/mL、作用時間控制在45min，中期卵母細(xì)胞能夠達(dá)到很好的去核效果。而在末期延邊黃牛卵細(xì)胞的中，脫羰秋水仙堿的最