綿羊體細(xì)胞克隆及早期克隆胚碎裂機(jī)制研究.pdf

1、本文以體外成熟不同時(shí)間卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體,以第4-10代成體雄性綿羊成纖維細(xì)胞為核供體,對(duì)去核、融合、不同激活方法、卵裂率、桑/囊胚率、囊胚率及克隆胚體內(nèi)發(fā)育等作了較系統(tǒng)地研究。并對(duì)影響克隆胚發(fā)育的早期胚胎的碎裂現(xiàn)象及其可能機(jī)制作了初步探討。主要結(jié)果與結(jié)論如下： 一、克隆胚胎的體外與體內(nèi)發(fā)育1.本試驗(yàn)使用的供體細(xì)胞取自3-4月齡雄性綿羊耳皮膚。染色體分析表明,75.9％的第12代成纖維細(xì)胞為二倍體,表明本實(shí)驗(yàn)所用的第4-10代細(xì)

2、胞滿足克隆的要求。 2.體外成熟18,20和24 h的卵母細(xì)胞的去核率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,去核率均在80％以上。 3.分別對(duì)兩種激活方案作了研究。結(jié)果表明,離子霉素+放線菌酮處理組的卵裂率,桑/囊胚率,囊胚率分別為84.7％,25.5％和5.2％；而A23187+6-DMAP處理組的卵裂率,桑/囊胚率,囊胚率分別為63.2％,18.7％和2.2％。離子霉素+放線菌酮處理組的卵裂率顯著高于A23187+6-DMAP組(P<0.0

3、5),但兩種激活方案對(duì)桑/囊胚率及囊胚率無顯著差異。 4.以IVM 20 h的卵母細(xì)胞為受體胞質(zhì)時(shí),重構(gòu)卵的融合率為51.2％,卵裂率為70.8％,受胎率為5.6％；而以IVM 22-24 h的卵為受體胞質(zhì)時(shí),重構(gòu)卵的融合率為77.4％,卵裂率為84.7％,受胎率為12.1％。表明IVM 22-24 h比IVM20 h的卵母細(xì)胞更適于克隆胚發(fā)育。二、早期克隆胚碎裂現(xiàn)象及其機(jī)制的初步探討1.在相同融合條件和激活條件下,不同胚胎培養(yǎng)

4、系統(tǒng)(CR1aa vs SOFaa)對(duì)早期克隆胚碎裂有明顯影響。CR1aa系統(tǒng)導(dǎo)致的胚胎碎裂率為50.6％,顯著高于SOFaa系統(tǒng)(19.2％,P<0.05)。 2.在CR1aa培養(yǎng)系統(tǒng)中,不同融合電壓對(duì)早期胚胎碎裂無明顯影響。使用180 V/mm,20μs的脈沖刺激與140V/mm,20μs的脈沖刺激分別引起50.6％和45.0％的胚胎碎裂,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.在較低融合電壓(140V/mm)條件下,不同濃度離子霉

5、素引起的早期胚胎碎裂有顯著差異。使用5.0μM離子霉素可使44.6％的胚胎發(fā)生碎裂,顯著高于2.5μM處理組(29.7％,P<0.05)。 4.在SOFaa系統(tǒng)中,不同激活方法(離子霉素聯(lián)合放線菌酮,A23187聯(lián)合6-DMAP)對(duì)早期克隆胚胎碎裂率無顯著差異。分別為21.3％和16.5％。 5.在SOFaa系統(tǒng)中,不同離子霉素濃度(5.0μM和2.5μM)對(duì)早期克隆胚胎碎裂率無顯著差異,分別為22.0％和19.1％。