轉(zhuǎn)蜘蛛Spidroin1基因綿羊早期克隆胚的研究.pdf

1、蜘蛛絲無與倫比的生物學特性決定了其在應用領域具有廣闊的應用前景。以生物學方法獲取具有蜘蛛絲特性的活性蛋白，亦或是通過轉(zhuǎn)基因的方法直接獲得類似蜘蛛絲的動物纖維，一直以來是許多科學研究者的奮斗目標。本研究利用蜘蛛拖絲蛋白基因四聚體4S、pcDNA3.1和pIRES2-EGFP載體，在構建pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S表達載體的基礎上，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將蜘蛛拖絲蛋白(Spidroin1)基因轉(zhuǎn)染細胞并獲得轉(zhuǎn)基因陽性細胞株;

2、以轉(zhuǎn)基因陽性細胞為核供體，采用體細胞核移植的方法獲得轉(zhuǎn)蜘蛛Spidroin1基因綿羊克隆胚;采用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因克隆胚的蜘蛛拖絲蛋白(Spidroin1)基因整合狀況。本研究的結果如下:
　　1.pcDNA3.1-4S及pIRES2-EGFP-4S表達載體的構建利用pcDNA3.1載體和蜘蛛拖絲蛋白基因四聚體4S構建了pcDNA3.1-4S表達載體，BglⅡ、BamHⅠ雙酶切及PCR鑒定顯示，蜘蛛拖絲蛋白基因4S已連接到pcD

3、NA3.1-4S中;利用pIRES2-EGFP載體和蜘蛛拖絲蛋白基因4S構建了pIRES2-EGFP-4S，XhoⅠ、BglⅡ雙酶切及PCR鑒定顯示，蜘蛛拖絲蛋白基因4S連接到pIRES2-EGFP中。
　　2.轉(zhuǎn)蜘蛛Spidroin1基因綿羊成纖維細胞系的建立將0.4μg/mL經(jīng)線性化的pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S，通過脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染利用常規(guī)方法經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)的綿羊成纖維細胞，用含有抗生素和含400μ

4、g/mLG418的培養(yǎng)基進行篩選，獲得轉(zhuǎn)pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S的陽性細胞;對獲得的轉(zhuǎn)基因陽性細胞進行形態(tài)學觀察、生長曲線、倍增時間等生物學特性檢測結果，符合正常成纖維細胞的特性。
　　3.綿羊卵母細胞獲取方法的篩選通過比較抽吸、切割、抽吸結合切割的方法對綿羊的獲卵效果，其結果，與抽吸和切割法相比，劃線法輔助的切割法，能夠獲得最多的A、B級卵母細胞（約8個/每個卵巢）。
　　4.綿羊卵母細胞體外成

5、熟將A、B級卵母細胞以TCM199-HCO3+2.2g/mLNaHCO3+5μg/mL FSH+1IU/mL LH+1μg/mL雌二醇+50μg/mL慶大霉素+10％FBS+0.38mmol/L丙酮酸鈉+10mmol/L Hepes為培養(yǎng)液，對綿羊卵母細胞進行體外成熟培養(yǎng)，可以獲得83.4％的最高成熟率。表明該成熟液適合用于綿羊卵母細胞的體外成熟。
　　5.成熟卵母細胞孤雌激活體外成熟綿羊卵母細胞用5μmol IA23187激活5

6、min后，再用2 mmol/L的6-DMAP培養(yǎng)4h，能夠獲得最高91.5％的激活率，激活后的孤雌胚經(jīng)培養(yǎng)后84.7％胚胎發(fā)育至桑椹胚。本研究結果顯示，IA23187聯(lián)合6-DMAP的激活方法可用于綿羊體外成熟卵母細胞的孤雌激活。
　　6.轉(zhuǎn)基因陽性細胞的體細胞核移植利用上述研究中建立的體細胞核移植程序，分別以綿羊成纖維細胞和轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因細胞進行體細胞核移植，其結果，正常綿羊體細胞融合率(72.7％)，與其相比，轉(zhuǎn)基因細胞的

7、融合率(70.7％)，兩者差異不顯著，表明外源基因的轉(zhuǎn)入對早期核移植重構胚的發(fā)育能力沒有顯著影響。
　　7.轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因陽性細胞的體細胞重構胚的發(fā)育能力
　　將采用體細胞核移植方法獲得的轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因重構胚進行體外培養(yǎng)，其結果與正常的綿羊成纖維細胞通過體外發(fā)育桑椹胚的比率(13.8％)相比，轉(zhuǎn)基因陽性細胞的體細胞的核移植的體外發(fā)育至桑椹胚的比率(11.6％)，兩者之間的差異不顯著;將獲得的轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因融合重構