轉(zhuǎn)fat-1基因克隆綿羊的制備及其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化分析.pdf

1、以轉(zhuǎn)基因技術(shù)和體細(xì)胞核移植相結(jié)合的方法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是目前生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜的主要技術(shù)手段。針對(duì)與肉質(zhì)改良相關(guān)的基因，我們分別構(gòu)建了CMV和CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的n-3多不飽和脂肪酸去飽和酶基因表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染到綿羊胎兒成纖維細(xì)胞中。將得到的陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植來制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。結(jié)果得到的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊出現(xiàn)了兩種不同的表達(dá)模式，為了探究可能導(dǎo)致其出現(xiàn)的原因，我們對(duì)兩種啟動(dòng)子來源的轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞、胚胎和動(dòng)物個(gè)體上進(jìn)行了甲基化檢測(cè)。

2、　　 1.CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)fat-1基因克隆綿羊的制備
　　 從線蟲總RNA中分離得到了n-3不飽和脂肪酸的fat-1基因，將其連入CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體pIRES2-EGFP的多克隆位點(diǎn)中，使其和綠色熒光蛋白的基因共表達(dá)。轉(zhuǎn)染并篩選綿羊胎兒成纖維細(xì)胞得到穩(wěn)定表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，將其用作體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。接著將轉(zhuǎn)基因的重構(gòu)胚移植到同期發(fā)情的受體蒙古羊的輸卵管中。5個(gè)月后，兩只克隆羊發(fā)育足月并產(chǎn)出，命名為H

3、001和H002。PCR反應(yīng)和Southern blots檢測(cè)顯示外源基因全長整合到了綿羊的基因組中。但在轉(zhuǎn)基因羊的組織中卻沒有檢測(cè)到fat-1 mRNA的表達(dá)。對(duì)肌肉組織進(jìn)行脂肪酸組成的分析也沒有檢測(cè)到外源基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明外源的fat-1基因在轉(zhuǎn)基因綿羊中發(fā)生了基因沉默。
　　 2.轉(zhuǎn)pCMV-fat1基因克隆綿羊的甲基化分析
　　 將得到的兩只轉(zhuǎn)pCMV-fat1基因克隆綿羊H001和H002的各種組織進(jìn)行C

4、MV啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化分析。經(jīng)過軟件分析，CMV啟動(dòng)子內(nèi)部有3個(gè)CpG島，選擇最長的CpG島作為甲基化測(cè)序的目標(biāo)。利用兩對(duì)BSP引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，可以特異性得擴(kuò)增出338 bp的DNA片段，含有一個(gè)CpG島共19個(gè)CpG位點(diǎn)。各種樣品擴(kuò)增出的片段經(jīng)過連接克隆載體pMD-19T Vector后進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和克隆胚胎中幾乎沒有發(fā)生甲基化；而在H001和H002的心、肺、肝、腿肌、腎、腦、皮膚、睪丸等組織中，均處于高

5、度甲基化狀態(tài)，甲基化的位點(diǎn)數(shù)占總測(cè)序位點(diǎn)數(shù)的比值平均達(dá)到92.6％。與CMV啟動(dòng)子共同進(jìn)入宿主細(xì)胞的SV40啟動(dòng)子在細(xì)胞和胚胎中完全沒有甲基化，而在分析的組織中卻高度甲基化，比值平均達(dá)到79.4％。表達(dá)情況與甲基化程度呈負(fù)相關(guān)，在細(xì)胞和胚胎中表達(dá)，而在各組織中不表達(dá)，這一結(jié)論與CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)fat-1基因表達(dá)的情況一致。
　　 3.CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)fat-1基因克隆綿羊的制備及不同水平上的甲基化分析
　　 為了與C

6、MV轉(zhuǎn)fat-1基因克隆綿羊進(jìn)行比較，我們制備了CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)fat-1基因克隆綿羊。載體構(gòu)建在質(zhì)粒pCMV-fat1的基礎(chǔ)上進(jìn)行，切除CMV啟動(dòng)子連入CAG啟動(dòng)子，最終構(gòu)建好的載體與原載體相比，除啟動(dòng)子不一樣外其余表達(dá)元件均相同。獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系后進(jìn)行體細(xì)胞核移植。430枚1-到2-細(xì)胞胚胎移植到90只受體羊的輸卵管中。50天妊檢有8只懷孕，妊娠率為8.9％。大約70天左右時(shí)，剖腹取出兩只胎兒，命名為N001和N002。用兩只胎

7、兒的背部組織制備胎兒成纖維細(xì)胞，得到的細(xì)胞系生長狀態(tài)良好。經(jīng)PCR和RT-PCR檢測(cè)均為fat-1基因陽性，流式細(xì)胞檢測(cè)綠色熒光細(xì)胞所占比例分別為14.90％和8.68％。對(duì)兩只胎羊的內(nèi)臟組織，包括心、肺、肝和腎，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)顯示外源基因fat-1在這些組織中均發(fā)生表達(dá)。接著，兩只CAG克隆羊發(fā)育足月并產(chǎn)出，命名為N003和N004。取部分耳組織制備成體成纖維細(xì)胞，得到的細(xì)胞系生長狀態(tài)良好，其中N003細(xì)胞有綠色熒光發(fā)出。經(jīng)PC

8、R和RT-PCR檢測(cè)顯示N003細(xì)胞為fat-1基因陽性。對(duì)CAG來源的各種不同樣本進(jìn)行CAG啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化分析顯示，CAG轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和核移植得到的胚胎幾乎沒有甲基化，而N001和N002的心、肺、肝、腎以及轉(zhuǎn)基因胎兒來源的成纖維細(xì)胞，除了N001和N002的肝臟處于中度甲基化狀態(tài)(平均為66.2％)外，其余均處于高度甲基化狀態(tài)，比值平均達(dá)到95.3％。這些結(jié)果表明CAG啟動(dòng)子受到宿主高度甲基化修飾的調(diào)節(jié)，但是沒有影響到其啟動(dòng)外源基