基于fat-1轉(zhuǎn)基因牛的自身安全評(píng)價(jià).pdf

1、n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)與人類的健康密切相關(guān)，但人體自身不能合成n-3 PUFAs。自1997年，Spychalla等在線蟲中獲得了一個(gè)脂肪酸脫氫酶基因fat-1后，多種富含n-3 PUFAs的fat-1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相繼被研制成功，使這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)品為人類提供必需的n-3 PUFAs成為了可能。隨著fat-1轉(zhuǎn)基因家畜的大量出生，涉及轉(zhuǎn)基因家畜的生物安全成為了人類倍受關(guān)注的問題，其中轉(zhuǎn)基因家畜自身健康是生物安全檢測(cè)的

2、一項(xiàng)重要內(nèi)容。截止目前，轉(zhuǎn)基因家畜自身健康和安全的評(píng)價(jià)雖已開展了一些研究，但多局限于動(dòng)物健康的某個(gè)方面，系統(tǒng)而全面評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因家畜自身健康的研究還未見報(bào)道。本研究利用體細(xì)胞核移植技術(shù)最終獲得了3頭成活的fat-1轉(zhuǎn)基因牛，高通量測(cè)序技術(shù)鑒定了其中一頭轉(zhuǎn)基因牛的fat-1基因整合在16號(hào)染色體的15726078bp處。通過對(duì)3頭fat-1轉(zhuǎn)基因牛在血液生化水平、基因漂移、自身基因表達(dá)變化、血漿蛋白表達(dá)變化及腸道菌群變化結(jié)果的系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)f

3、at-1基因的轉(zhuǎn)入對(duì)轉(zhuǎn)基因牛的脂類代謝、免疫、心血管系統(tǒng)、抗應(yīng)激等方面均表現(xiàn)出調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于建立轉(zhuǎn)基因家畜，特別是轉(zhuǎn)基因大家畜的自身安全評(píng)價(jià)體系，為獲得健康、安全的轉(zhuǎn)基因家畜的相關(guān)研究提供了有價(jià)值的參考資料。主要研究結(jié)果如下:
　　1.fat-1轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)及常規(guī)分析
　　通過轉(zhuǎn)基因及體細(xì)胞核移植技術(shù)(SCNT)獲得了9頭犢牛，6頭犢牛被鑒定為fat-1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性牛，脂肪酸檢測(cè)證實(shí)了fat-1基因的轉(zhuǎn)入可以提升牛體

4、內(nèi)n-3PUFAs的含量，降低n-6 PUFAs的含量。血液生化水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)fat-1基因的轉(zhuǎn)入顯著降低了犢牛ALT及成年牛AST、GLU、TC和LDL-C的水平。常規(guī)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因牛腸道糞便、圈舍中土壤及其周圍200 m各方位土壤微生物，均未發(fā)現(xiàn)有fat-1基因的存在。
　　2.fat-1轉(zhuǎn)基因牛整合位點(diǎn)分析
　　應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)fat-1轉(zhuǎn)基因牛(FD006)進(jìn)行了外源基因整合位點(diǎn)分析，結(jié)果表明fat-1基因整合

5、在牛16號(hào)染色體的15726078bp處，且為單拷貝，根據(jù)測(cè)序獲得的插入位點(diǎn)及其附近reads的結(jié)果分析，顯示FD006為雜合子轉(zhuǎn)基因牛，PCR的驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)了fat-1基因確實(shí)插入了牛16號(hào)染色體的15726078 bp處，而且確實(shí)為雜合子轉(zhuǎn)基因牛。本研究為轉(zhuǎn)基因牛的整合位點(diǎn)分析、外源基因定點(diǎn)整合以及穩(wěn)定表達(dá)等研究提供了技術(shù)路線與理論依據(jù)。
　　3.fat-1轉(zhuǎn)基因?；虮磉_(dá)變化研究
　　為分析fat-1基因的轉(zhuǎn)入對(duì)牛基因

6、表達(dá)的影響，提取fat-1轉(zhuǎn)基因牛和野生型牛血液的總RNA，進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)。結(jié)果表明，有2042個(gè)基因表達(dá)存在顯著差異，其中797個(gè)基因在fat-1轉(zhuǎn)基因牛中是上調(diào)表達(dá)的，其余1245個(gè)基因則下調(diào)表達(dá)。基于2042個(gè)差異基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)90個(gè)GO Terms被顯著富集，這些GO Terms主要與機(jī)體的脂類代謝、細(xì)胞行為、免疫及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)，其中8個(gè)GO Terms中包含了36個(gè)發(fā)生顯著變化的脂類代謝關(guān)鍵基因。K

7、EGG富集分析進(jìn)一步獲得了與脂類代謝，特別是與多不飽和脂肪酸的代謝密切相關(guān)的“PPAR signaling pathway”代謝通路。應(yīng)用Real-time PCR對(duì)芯片檢測(cè)獲得的16個(gè)脂類代謝關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了芯片獲得的結(jié)果是可信的。綜合以上結(jié)果，發(fā)現(xiàn)fat-1基因的轉(zhuǎn)入引起了牛自身基因表達(dá)水平的變化，這些變化的基因在機(jī)體的脂類代謝、免疫、神經(jīng)發(fā)育等生物學(xué)通路表現(xiàn)出調(diào)節(jié)作用。
　　4.fat-1轉(zhuǎn)基因牛血漿蛋白組學(xué)研究

8、r>　　利用2D-雙向電泳及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)fat-1轉(zhuǎn)基因牛血漿蛋白組學(xué)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，共有15個(gè)血漿差異蛋白被鑒定;對(duì)這15個(gè)差異蛋白及其互作蛋白的GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與了機(jī)體的脂類代謝、免疫、應(yīng)激、神經(jīng)發(fā)育和血液凝固等生物學(xué)通路的調(diào)節(jié);在18個(gè)重要的脂類代謝生物學(xué)通路中，有12個(gè)通路都富集到了APOA1，表明fat-1基因參與對(duì)脂類代謝的調(diào)控可能與APOA1有密切關(guān)系;血漿APOA1檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因牛血漿

9、中APOA1含量顯著高于野生型牛，其表達(dá)水平與LDL-C高度負(fù)相關(guān)(r=-0.90)，與HDL-C/TC比值存在顯著正相關(guān)(r=0.69)。綜合以上結(jié)果，與野生型牛比較發(fā)現(xiàn)，fat-1基因的轉(zhuǎn)入使牛血漿中的一些蛋白表達(dá)發(fā)生了變化，并發(fā)現(xiàn)fat-1基因可能會(huì)介導(dǎo)APOA1的表達(dá)參與轉(zhuǎn)基因牛脂類代謝的調(diào)控。
　　5.fat-1轉(zhuǎn)基因牛腸道微生物菌群的研究
　　采用高通量測(cè)序技術(shù)，分別對(duì)3頭fat-1轉(zhuǎn)基因牛和3頭野生型牛的直腸糞

10、便進(jìn)行了基于16s rDNA V4可變區(qū)腸道菌群多樣性及組成的比較分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因牛和野生型牛共獲得9714個(gè)OTUs的分類，轉(zhuǎn)基因牛的OTUs分類（8907個(gè)）明顯少于野生型牛（9488個(gè)）;物種多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因牛的Chao和Shannon指數(shù)均顯著低于野生型牛(p＜0.05)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，fat-1基因的轉(zhuǎn)入也改變了牛腸道菌群的組成和表達(dá)豐度。其中物種注釋豐度比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛間有3個(gè)門（廣古菌門、變

11、形菌門、螺旋體門），9個(gè)屬（紫單胞菌屬、擬桿菌屬、甲烷短桿菌、密螺旋體屬、梭菌屬、毛螺菌屬、羅氏菌屬、消化球菌屬、丁酸弧菌屬）存在物種豐度差異(p＜0.05)。結(jié)合腸道菌群的組成、物種豐度比較結(jié)果及血糖、血脂生化檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Dorea、Roseburia、Succinivibrio和Alistipes與血糖、血脂的變化存在一定的相關(guān)性。此外，也發(fā)現(xiàn)與應(yīng)激有關(guān)的Odoribacter菌屬在轉(zhuǎn)基因牛腸道中顯著降低。綜合本研究結(jié)果表明，fa