Fat-1表達載體構建及轉Fat-1基因薩?？搜虺衫w維細胞系的建立研究.pdf

1、目的:ω-3PUFAs對于維持生命有機體的正常發(fā)育和生長,防治各種疾病都有至關重要的作用,由于缺乏能夠將ω-6PUFAs轉化成ω-3PUFAs的脫氫酶基因,人體內的ω-6/ω-3PUFAs達不到1:1理想的平衡,所以每天必須攝入一定量的ω-3PUFAs,來保證有機體正常的功能和自身穩(wěn)定。目前富含ω-3PUFAs食物主要是深海魚類,來源范圍很窄,導致人體內ω-6PUFAs過多而ω-3PUFAs嚴重不足,對嬰幼兒智力發(fā)育、心腦血管疾病和癌癥

2、的預防起不了積極作用。因此從家畜繁殖與育種的角度出發(fā),制備能夠表達ω-3PUFAs的脫氫酶基因Fat-1的新品種綿羊,從而培育出富含ω-3PUFAs高品質羊肉。
　　方法:1.Fat-1表達載體構建及轉基因細胞系建立
　　采用組織塊附植法分離得到了18月齡薩?？斯虺衫w維細胞系;通過PCR擴增得到了人泛素啟動子UbB序列,對秀麗隱桿線蟲Fat-1基因密碼子根據綿羊對同義密碼子使用偏好性進行優(yōu)化,然后由公司合成獲得oFat-1

3、基因序列;雙酶切法從pcDNA3.1中獲得GBHpolyA序列,將上述3段序列共同插入pCMV-DsRed2-1載體的多克隆位點(MCS),得到重組真核表達載體pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed,載體序列再經酶切和測序,結果與預期一致。用單酶切法將表達載體線性化后,采用脂質體包裹后轉染綿羊成纖維細胞,經G418抗性和紅色熒光標記篩選得到陽性細胞,并進行PCR和反轉錄PCR鑒定,HPLC檢測細胞中不飽和脂肪酸的變化。

4、>　　2.轉基因綿羊的制備
　　將得到的轉Fat-1的綿羊成纖維細胞作為核移植供體細胞,移入去核后的綿羊成熟卵母細胞內制備克隆胚,經過融合、激活、發(fā)育得到的2細胞期重構胚,移入同步處理的31只受體羊子宮內,6-7枚/羊,妊娠并產下羔羊后PCR初步檢測外源基因,分別取三只羊耳部皮膚體外培養(yǎng),進行細胞染色體數目分析。
　　結果:構建的真核表達載體序列正確,Fat-1基因能夠在綿羊成纖維細胞基因組中正常表達,促進細胞ω-6PUFA

5、s向ω-3PUFAs轉化,ω-3PUFAs占總量的百分比從11.48％增加到24.41%,ω-6PUFAs的百分比從88.52%下降到75.59%,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比值從7.82±0.18下降到3.10±0.03,差異極顯著(P<0.01)。經過胚胎移植后有3只母羊妊娠,妊娠率9.67%,并順利產下3只羔羊。經PCR初步檢測有兩只為轉基因陽性,分別取三只羊耳部皮膚體外培養(yǎng),進行細胞染色體數目分析,顯示均具有正常的二倍體