手工克隆生產(chǎn)轉(zhuǎn)植酸酶基因豬的研究.pdf

1、隨著畜牧業(yè)快速迅猛的發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖業(yè)的糞污已成為我國(guó)環(huán)境污染的主要來(lái)源之一。豬雞等單胃動(dòng)物不能分泌植酸酶，使大量的磷從動(dòng)物的糞中排出體外，對(duì)環(huán)境造成了很大的影響。所以，提高飼料中植酸磷的利用率，對(duì)保護(hù)環(huán)境和磷資源的節(jié)約利用有非常重大的意義。植酸酶是一種水解酶，可以將植酸分解成肌醇和磷酸而被動(dòng)物消化吸收。因此，可通過(guò)植酸酶的作用增加日糧中植酸磷的利用率來(lái)減少糞中磷的排放，從而減輕磷對(duì)環(huán)境的污染。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

2、生產(chǎn)技術(shù)水平的逐漸提高，為這些問(wèn)題的解決提供了一條新途徑。通過(guò)豬和禽等單胃動(dòng)物自身消化道產(chǎn)生具有較高生物活性的內(nèi)源性植酸酶，已經(jīng)成為解決單胃動(dòng)物高磷糞便污染的一種研究策略和手段。
　　本課題成功地將編碼對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶具有穩(wěn)定性，對(duì)底物有較高親和力的植酸酶的基因與豬腮腺特異性表達(dá)的分泌蛋白調(diào)控序列（PSP啟動(dòng)子）進(jìn)行整合，構(gòu)建豬腮腺特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體p-PSP-Intron-Cafp和PSP-Cafp-IRES-EGFP。

3、PSP-Cafp-IRES-EGFP轉(zhuǎn)基因載體在小鼠腮腺細(xì)胞中成功組織特異性表達(dá)。
　　本課題建立并優(yōu)化了胚胎成熟培養(yǎng)體系。在成熟培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)22-24h時(shí)，卵母細(xì)胞的成熟液不添加FBS的成熟效果優(yōu)于添加FBS的成熟效果。在培養(yǎng)體系中，pzm-3培養(yǎng)液比NCSU培養(yǎng)液更適于胚胎培養(yǎng)。當(dāng)使用NCSU培養(yǎng)液時(shí)，在培養(yǎng)的第4天添加10％FBS可以顯著提升囊胚率。在孤雌激活試驗(yàn)中，激活參數(shù)為120V，30μs，3脈沖的效果最好。<

4、br>　　本研究通過(guò)電轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，將p-PSP-Intron-Cafp載體轉(zhuǎn)染大白豬(DB)和長(zhǎng)白豬(LW)的成纖維細(xì)胞，成功獲得了轉(zhuǎn)植酸酶Cafp基因的DB和LW兩組轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞系。以這些陽(yáng)性細(xì)胞系為手工克隆的供體細(xì)胞，通過(guò)手工克隆技術(shù)在體外生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因囊胚810枚，將其中質(zhì)量較好的712枚囊胚移植到6頭受體母豬體內(nèi)，成功受孕4頭。3頭受孕豬成功分娩活仔豬14頭，斷奶存活仔豬6頭。PCR結(jié)果顯示，4頭斷奶前死亡的仔豬和3頭存活的

5、仔豬攜帶植酸酶Cafp基因。FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)斷奶的6頭仔豬有5頭為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體。PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，斷奶成活的6頭轉(zhuǎn)基因豬唾液均有陽(yáng)性蛋白帶，但質(zhì)譜測(cè)定卻沒(méi)有檢測(cè)到植酸酶基因Cafp的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)豬6月齡時(shí)進(jìn)行磷的表觀消化率測(cè)定，結(jié)果顯示對(duì)照組磷的表觀消化率平均為47.2％，轉(zhuǎn)植酸酶基因陰性豬組平均為44.7％，轉(zhuǎn)植酸酶基因陽(yáng)性豬組平均為57.17％。轉(zhuǎn)植酸酶基因陽(yáng)性豬磷的排放量平均比對(duì)照組降低了10百分點(diǎn)，差異顯著(P＜0.05)。