高產(chǎn)植酸酶菌株篩選、基因克隆及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、植酸酶(myo-inostol hexakisphosphate phosphohydrolase，EC 3.1．3.8)是一種能降解植酸(肌醇六磷酸)為肌醇和磷酸的酶。具有增加動物對礦物質(zhì)的利用，促進動物的生長發(fā)育，降低磷的排放量和減少環(huán)境污染的作用。 植酸及植酸鹽廣泛存在于植物組織及相應(yīng)的糧食產(chǎn)品中，植酸磷的含量占總磷的60％以上，因其不能被單胃動物利用，直接被排出體外，加重了環(huán)境中磷的污染且造成磷資源的浪費，并使得養(yǎng)殖業(yè)要

2、額外加入動物能利用的磷源，提高了成本。在單胃動物飼料中添加植酸酶可有效解決這一問題。本文采用底物消解法篩選出一株高產(chǎn)植酸酶的黑曲霉，命名為Aspergillus，niger N-3，并以此為原材料，采用PCR法克隆植酸酶基因；對該菌株直接發(fā)酵產(chǎn)生的胞外植酸酶進行了純化，并在此基礎(chǔ)上研究了該酶的基本酶學(xué)性質(zhì)；此外，本文還以畢赤酵母表達的．Aspergillus sp 植酸酶為材料，用化學(xué)修飾法研究了植酸酶參與催化的必需氨基酸殘基——組氨酸

3、殘基。主要研究結(jié)果如下： 1．高產(chǎn)植酸酶菌株的篩選從不同來源的土壤及其它樣品中分離得到104株菌，從中篩選獲得76株能夠產(chǎn)生透明消解圈的菌株，液體發(fā)酵證明，有30株菌具有分泌胞外植酸酶的能力。其中大多數(shù)酶活力在8U/mL-50 U/mL之間，酶活最高的一株菌株液體發(fā)酵時其酶活最高可達495U/mL，此菌株命名為Aspergillus niger N-3，并以此作為本課題的主要研究材料。 2．植酸酶基因的克隆采用氯化芐法提

4、取黑曲霉Aspergillus niger N-3的基因組，以此為模板應(yīng)用特異引物對植酸酶基因phyA進行PCR擴增，構(gòu)建克隆載體并對陽性克隆進行測序鑒定。該植酸酶基因的編碼區(qū)有1347個核苷酸，編碼448個氨基酸。其核苷酸序列與Aspergillus，nigerNRRL3135 phyA基因的同源性為91.35％(不含內(nèi)含子序列)，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為94.87％，與大多數(shù)來源于曲霉的植酸酶(playA)類似，具有10個潛在的糖基

5、化位點。 3．植酸酶的純化將Aspergillus nigerN-3發(fā)酵液首先采用硫酸銨分級沉淀的方法進行粗分離，加入30％飽和度的硫酸銨溶液沉淀3h后，離心收集上清，采用80％飽和度的硫酸銨溶液繼續(xù)沉淀，8h后離心，沉淀溶于100mM NaAc-HAc pH 5.5緩沖液，透析并濃縮，將濃縮液過SephadexG-75分子篩層析純化，獲得兩個峰，其中一個峰具有植酸酶活性，其峰頂處的組分經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一條帶并測得其分

6、子量60-80 kDa。 4．植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)．Aspergillus niger N-3所產(chǎn)植酸酶最適反為55℃(保溫10分鐘)，最適pH分別為pH 2.0和pH 5.5，其中處的酶活力比pH 5.5處的酶活力高約30％，更適合于單胃動物的環(huán)境。該酶熱穩(wěn)定性較好，在80℃、85℃及90℃下處理5分鐘別保持57％，49％和45％的酶活力。以植酸鈉為底物時測得K<,m>為132.3μM，以pNPP為底物測得K<,m>為2.23 m