歐美楊108號(hào)轉(zhuǎn)蜘蛛殺蟲肽+Bt毒蛋白嵌合基因研究.pdf

1、楊樹是世界上中緯度地區(qū)廣泛栽培的重要速生用材樹種，但是楊樹的蟲害種類多，危害十分嚴(yán)重，尤其是大面積的楊樹人工林。而楊樹抗蟲基因工程為解決這個(gè)難題提供了一條有效途徑。歐美楊108號(hào)(Populusnigra×Populusdeltoids“108”)是美洲黑楊(Populusnigra)與歐洲黑楊(Populusdeltoids)的人工雜種無(wú)性系。本研究以歐美楊108號(hào)為外植體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將抗蟲基因(蜘蛛殺蟲肽+Bt毒蛋白

2、的嵌合基因)導(dǎo)入該受體中。通過(guò)試驗(yàn)得出以下結(jié)論： (1)通過(guò)除菌抗生素的篩選試驗(yàn)，可以看出在7種抗生素中以注射用頭孢唑啉鈉抑菌效果最佳，因此，試驗(yàn)所選用的除菌抗生素為注射用頭孢唑啉鈉； (2)根據(jù)葉片對(duì)頭孢唑啉鈉的敏感試驗(yàn)，最終確定除菌時(shí)，頭孢唑啉鈉的濃度為1000mg/L； (3)葉片的敏感試驗(yàn)結(jié)果表明，在篩選轉(zhuǎn)化體時(shí)，卡那霉素的臨界濃度確定為30mg/L； (4)通過(guò)生根敏感試驗(yàn)，最終確定選擇生根培養(yǎng)

3、基卡那霉素的臨界濃度為20mg/L； (5)成功建立歐美楊108號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化程序：菌株活化→葉片預(yù)培養(yǎng)2～3d→液體菌株OD600=0.05～0.1，侵染5～10min→37℃，共培養(yǎng)2～3d→頭孢唑啉鈉1000mg/L脫菌，卡那霉素30mg/L篩選→脫菌、篩選數(shù)次→獲得卡那霉素抗性芽→一個(gè)月后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中(頭孢唑啉鈉1000mg/L脫菌，卡那霉素20mg/L篩選)生根培養(yǎng)→獲得卡那霉素抗性植株； (6)試驗(yàn)侵染轉(zhuǎn)

4、化95個(gè)葉盤共1713個(gè)葉片，獲得卡那霉素抗性芽8個(gè)，轉(zhuǎn)化率為4.67‰； (7)經(jīng)PCR檢測(cè)，凝膠電泳結(jié)果顯示，8個(gè)卡那霉素抗性芽中，6個(gè)存在目的基因； (8)在以上6個(gè)存在目的基因抗性芽分化的若干植株中，平均每個(gè)樣抽取3株，取其葉片做GUS檢測(cè)，結(jié)果顯示，全部葉片均呈陽(yáng)性，GUS陽(yáng)性為100％； (9)經(jīng)PCR-Southern印跡雜交檢測(cè)，結(jié)果進(jìn)一步表明，目的基因(蜘蛛殺蟲肽+Bt毒蛋白的嵌合基因)已成功整