轉(zhuǎn)Bt基因甘藍(lán)的抗蟲性研究.pdf

1、本實驗分別對激素、外植體類型、無菌苗培養(yǎng)時間及硝酸銀和乙酰丁香酮濃度等影響甘藍(lán)08J80外植體再生的因素進(jìn)行了研究，建立了甘藍(lán)下胚軸高效再生體系。利用該再生體系采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將表達(dá)不同蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因CryIAc、CryIC分別轉(zhuǎn)化甘藍(lán)中甘8號和08J80，獲得再生植株。將生根植株置于添加5mg/L卡那霉素的生根培養(yǎng)基上篩選。提取篩選后存活且生長正常的植株的DNA，以目的基因為引物,進(jìn)行PCR檢測，獲得擴(kuò)增出目的基因的植株

2、。以CryIAc基因為探針，將部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern blot分析，證明外源基因已經(jīng)整合到甘藍(lán)基因組中。提取轉(zhuǎn)基因植株根、莖、幼葉和成熟葉部位的的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過RT-PCR實驗以檢測抗蟲基因在轉(zhuǎn)基因植株各組織的表達(dá)情況。室內(nèi)離體葉片抗蟲試驗中，觀察轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)葉片和野生型甘藍(lán)葉片的損害程度，統(tǒng)計幼蟲校正死亡率，平均單蟲重，解剖正常死亡和中毒死亡的蟲體，觀察其腸道的差異。本研究獲得的主要結(jié)果如

3、下：
　　 1.建立的甘藍(lán)下胚軸再生體系為：選取6d至7d苗齡的下胚軸，將其置于MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L+AgNO35mg/L的芽分化培養(yǎng)基中，芽分化為叢生芽，頻率高達(dá)80％。
　　 2.獲得的甘藍(lán)再生植株中，轉(zhuǎn)CryIAc基因的中甘8號植株369株，轉(zhuǎn)CryIC基因的中甘8號甘藍(lán)412株，轉(zhuǎn)CryL4c基因的08J80750株。在不定芽生根過程中，雜交甘藍(lán)的生根率達(dá)到60％,08J80的生根

4、率約為10％，其中08J80甘藍(lán)在不定芽及生根階段玻璃化很嚴(yán)重。
　　 3.在含有5mg/L卡那霉素的生根培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化植株，獲得轉(zhuǎn)CryIAc基因的雜交甘藍(lán)5株，轉(zhuǎn)CryIC基因的中甘8號甘藍(lán)5株，轉(zhuǎn)CryIAc基因的08J80甘藍(lán)3株。
　　 4.PCR檢測，能夠擴(kuò)增出目的條帶的植株中，轉(zhuǎn)CryIAc基因的中甘8號甘藍(lán)4株，轉(zhuǎn)CryIC基因的中甘8號甘藍(lán)4株，轉(zhuǎn)CryIAc基因的08J80甘藍(lán)3株。陽性檢測率超過9

5、0％。
　　 5.部分轉(zhuǎn)CryIAc植株的Southern blot結(jié)果表明外源基因已經(jīng)整合到甘藍(lán)的基因組中。
　　 6.部分轉(zhuǎn)CryIAc基因植株的RT-PCR結(jié)果顯示，CryIAc基因在轉(zhuǎn)基因植株各組織呈組成型表達(dá)。
　　 7.室內(nèi)離體葉片抗蟲試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株葉片的損害程度較輕，野生型植株葉片損害嚴(yán)重；啃食轉(zhuǎn)基因植株葉片的小菜蛾在24h至72h時期內(nèi)出現(xiàn)中毒死亡現(xiàn)象，啃食野生型甘藍(lán)葉片的小菜蛾蟲體活潑