rstB基因表達(dá)定位、功能驗(yàn)證及苜蓿的耐鹽性遺傳改良.pdf

1、rstB基因來(lái)源于費(fèi)氏中華根瘤菌(SinorhizobiumFredii)耐鹽突變株RT19。但該基因的耐鹽機(jī)理不清楚，沒(méi)有在植物上應(yīng)用的研究報(bào)道。在NCBIGene-Bank中的同源比對(duì)信息顯示，rstB基因?yàn)橐惶腔D(zhuǎn)移酶基因，參與細(xì)胞壁的合成。在研究rstB基因在煙草中的表達(dá)定位，驗(yàn)證其耐鹽性基礎(chǔ)上，我們利用它對(duì)苜蓿進(jìn)行了耐鹽性遺傳改良。 基于對(duì)rstB基因進(jìn)行真核生物偏愛(ài)性密碼子改造和人工合成，并在大腸桿菌中驗(yàn)證mrstB

2、基因表達(dá)蛋白效果的基礎(chǔ)上，采用重組克隆的方法構(gòu)建rstB-GFP和mrstB-GFP融合基因表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因煙草再生苗。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)融合基因煙草的根部有很強(qiáng)的綠色熒光，莖中導(dǎo)管、葉脈導(dǎo)管和氣孔內(nèi)壁有綠色熒光，并且，mrstB-GFP煙草相應(yīng)部位熒光更強(qiáng)。提取根、莖、葉的可溶性蛋白進(jìn)行Western檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)融合基因煙草根中分別檢測(cè)到rstB-GFP或mrstB-GFP融合蛋白，而葉片和莖檢測(cè)不到。質(zhì)壁分

3、離試驗(yàn)顯示，熒光區(qū)在細(xì)胞膜外側(cè)，靠近細(xì)胞壁。免疫膠體金定位技術(shù)檢測(cè)rstB-GFP融合蛋白結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)融合基因煙草的細(xì)胞壁上特異性地結(jié)合大量的膠體金顆粒，表明rstB蛋白是分泌型蛋白，定位在細(xì)胞壁上，有在根部表達(dá)(或積累)的偏好性。 構(gòu)建帶有rstB和mrstB而無(wú)常規(guī)標(biāo)記基因的表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得NaCl抗性的煙草再生苗。分子鑒定顯示，直接用170mMNaCl為選擇壓篩選獲得的再生苗PCR陽(yáng)性率為80％以上；獲得再生芽后

4、，再用200mMNaCl篩選獲得的再生苗PCR陽(yáng)性率在60％以上。轉(zhuǎn)mrstB基因煙草的再生苗在兩種篩選條件下，PCR陽(yáng)性率均較高。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，rstB和mrstB均可以提高植物的耐鹽性，rstB基因改造有效，它們可以作為篩選標(biāo)記基因。 酵母雙雜交篩選與rstB蛋白互作的蛋白因子的試驗(yàn)結(jié)果顯示，互作蛋白中有典型的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，有參與胞外基質(zhì)和胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)、定位在細(xì)胞膜上的膜整合蛋白相似蛋白，有類似于細(xì)胞壁締合蛋白激酶胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

5、(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的蛋白，有參與次級(jí)代謝調(diào)控的一些酶類，也有已經(jīng)證明可以提高植物的耐鹽性或是參與超敏反應(yīng)的蛋白。可見(jiàn)，rstB蛋白的表達(dá)會(huì)與植物體內(nèi)一系列蛋白發(fā)生作用，而這種互作應(yīng)該與rstB基因提高植物的耐鹽性相關(guān)。但是，rstB蛋白與植物內(nèi)源蛋白互作是如何影響植物耐鹽性的還有待深入研究。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得了三個(gè)品種苜蓿的轉(zhuǎn)基因再生苗。耐鹽試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片外植體可在含1.0％NaCl的培養(yǎng)基上形成愈傷，

6、體細(xì)胞胚可以在含有0.3％NaCl的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)；而野生型苜蓿在含0.5％NaCl培養(yǎng)基上愈傷形成就有受抑制表現(xiàn)，體細(xì)胞胚在含0.2％NaCl的MS培養(yǎng)基上就不能萌發(fā)。轉(zhuǎn)基因苜蓿種子萌發(fā)率、根長(zhǎng)都優(yōu)于對(duì)照。模擬田間耐鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因T1代煙草、苜蓿，在NaCl脅迫下較對(duì)照表現(xiàn)較快的生長(zhǎng)速度，較高的生物量和較好的植株形態(tài)。轉(zhuǎn)基因煙草可以在200mMNaCl脅迫下完成生活史，轉(zhuǎn)基因苜?？梢栽?0mMNaCl脅迫下完成生活史，在10