截形苜蓿（Medicago truncatula）鹽誘導差異表達基因的克隆及功能分析.pdf

1、土壤鹽漬化分布范圍廣，整治改造困難，對農作物推廣種植和生產構成重大阻礙。因此改良農作物的鹽耐受能力，利用鹽漬化土壤是農業(yè)生產上亟待解決的問題。研究表明植物的抗鹽性狀是一個由多基因控制的數量性狀，這決定了抗鹽機制的復雜性。雖然進行了廣泛的研究探討，但目前人們對控制植物抗鹽起作用的關鍵相關基因及其分子機制等還不很清楚，這就嚴重阻礙了人們通過遺傳選擇或轉基因技術等途徑來顯著提高植物整體的抗鹽能力。本研究旨在通過分離和克隆與截形苜蓿鹽誘導表達相

2、關基因的探索性研究，初步揭示參與苜?？果}相關基因的種類和數量，為進一步深入開展植物抗鹽的分子機理研究及將來通過遺傳轉化選擇提高苜?？果}性提供理論基礎。本研究取得的主要結果如下： 1.應用抑制性消減雜交(SSH)技術成功構建了苜蓿鹽脅迫誘導下生長與正常生長的差異表達cDNA文庫。以美國農業(yè)部提供的澳大利亞產的截形苜蓿（Medicago truncatula,australia）為材料，分離Poly(A)+ RNA，反轉錄合成單鏈及

3、雙鏈cDNA，經酶切成為平均大小400~600bp的片段。將鹽脅迫誘導的cDNA分成兩組，分別與2種不同的接頭連接，再與正常生長的cDNA進行2次消減雜交和2次抑制性PCR擴增，將第2次PCR產物純化后與pMD-18T 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行文庫擴增，最終構建得到了具有高消減效率的截形苜蓿鹽脅迫抗性相關正向cDNA文庫。文庫擴增后得到超過500個白色陽性克隆，隨機挑選29個克隆進行PCR鑒定，鑒定結果表明插入片段主

4、要分布在250~750bp 之間。 2.應用反向Northern斑點雜交技術從消減cDNA文庫中隨機提取318個白斑，高通量篩選得到173個差異表達的克隆。分別用地高辛標記鹽脅迫誘導截形苜蓿和正常生長截形苜蓿cDNA作為雜交探針，對構建的cDNA消減文庫利用反向Northern斑點雜交技術篩選出173個差異表達克隆，隨機挑選50個測序后得到49個質量合格的EST序列。根據在GenBank非冗余核酸數據庫(nr)和EST數據庫中B