GsbZIP33和GsCBRLK基因轉(zhuǎn)化肇東苜蓿及其耐鹽性分析.pdf

1、鹽害是作物生長發(fā)育的主要限制因子之一，嚴重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境所面臨的一個全球性問題。培育耐鹽堿的作物品種是推動鹽堿化地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的有效措施。隨著分子生物學與基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)向目標作物導入與抗逆相關(guān)的目的基因，已成為改良作物耐逆性、培育抗逆新品種的重要途徑。特別是導入在信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡中起調(diào)控作用的抗逆基因，如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶基因，可達到綜合改良作物抗逆性的效果。紫花苜蓿(Medicago

2、sativa L.)素有“牧草之王”的美譽，是世界上利用最早、栽培最廣泛的優(yōu)質(zhì)豆科牧草，抗逆性強，具有耐寒、抗旱、耐鹽堿等特性，在黑鈣土、栗鈣土和鹽堿土上均能良好生長。然而苜蓿適宜在輕度鹽堿地種植，在中、重度鹽漬化土地上種植則受到很大限制。培育具有較強耐鹽性的紫花苜蓿新品種進行鹽堿地改良，是合理開發(fā)利用鹽漬化土地資源的有效措施。傳統(tǒng)的紫花苜?？鼓嬗N，周期長，并且其高耐鹽堿種質(zhì)資源匱乏，在耐鹽性的提高上很難達到突破性進展。而通過基因工程

3、手段，利用苜蓿近緣種質(zhì)資源，將野生耐鹽資源的耐鹽基因?qū)朐耘嗥贩N，培育具有較強耐鹽性的轉(zhuǎn)基因苜蓿新品種已成為紫花苜?？鼓嬗N的重要途徑。野生大豆具有豐富的耐逆基因資源，實驗室前期構(gòu)建了耐鹽東北野生大豆低溫、干旱、高鹽脅迫反應的基因表達譜。
　　 本研究選取在滲透脅迫早期應答網(wǎng)絡中起調(diào)控作用的野生大豆耐鹽基因GsbZIP33和GsCBRLK，轉(zhuǎn)化肇東苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhaodong)。為了對獲得的轉(zhuǎn)

4、基因苜蓿的耐鹽性進行鑒定，本研究對轉(zhuǎn)基因受體肇東苜蓿苗期的耐鹽性進行了初步研究，確定了肇東苜蓿的耐鹽程度。并以此為參考對轉(zhuǎn)GsbZIP33和GsCBRLK基因肇東苜蓿進行了耐鹽性分析。主要研究結(jié)果如下：⑴獲得轉(zhuǎn)GsbZIP33和GsCBRLK基因肇東苜蓿。采用農(nóng)桿菌介導法對肇東苜蓿進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)GsbZIP33基因肇東苜蓿抗性植株101株，其中PCR陽性植株55株，PCR陽性率54％；獲得轉(zhuǎn)GsCBRLK因肇東苜?？剐灾仓?5株，

5、PCR陽性植株36株，PCR陽性率48％。對部分PCR陽性植株進行RT-PCR。檢測，證明目的基因能夠在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄并超量表達。⑵確定了肇東苜蓿耐鹽篩選濃度。了對獲得的轉(zhuǎn)基因苜蓿進行耐鹽性分析，本研究對轉(zhuǎn)基因受體肇東苜蓿苗期的耐鹽性進行了初步研究，通過不同鹽脅迫程度(0、50、100、200、300、400mmol/L NaCl)和脅迫時間(0、3、6、9、12、15、21 d)下的表型觀察及相關(guān)生理指標的分析，確定了肇東苜蓿的耐鹽

6、篩選濃度。低濃度鹽脅迫對其生長無顯著影響，肇東苜蓿具有較強的耐鹽性，能夠抵抗持續(xù)15 d的200 mmol/L的鹽脅迫，但難以耐受300 mmol/L的鹽脅迫，特別是400 mmol/L高鹽脅迫。因此在對轉(zhuǎn)基因肇東苜蓿進行耐鹽性分析時，可以此為參考，選定300 mmol/L作為脅迫濃度，400 mmol/L作為致死濃度。⑶獲得耐鹽性提高的轉(zhuǎn)GsbZIP33和GsCBRLK基因肇東苜蓿。對轉(zhuǎn)GsbZIP33和GsCBRLK基因肇東苜蓿進行

7、耐鹽性分析，高濃度鹽處理下的表型以及相關(guān)生理生化指標的分析結(jié)果均表明，目的基因在肇東苜蓿中的超量表達明顯提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性。300 mmol/L NaCl脅迫15 d后，野生型苜蓿受害嚴重，生長發(fā)育受抑制，葉片逐漸變黃、卷曲、萎蔫，而轉(zhuǎn)基因苜蓿只受到輕微影響，仍能正常生長。在400mmol/L NaCl處理下，大部分野生型苜蓿死亡，存活植株的生長也嚴重受抑制；而轉(zhuǎn)基因苜蓿只有極少數(shù)植株死亡，存活植株的生長雖有所抑制，但表現(xiàn)明顯好于

8、野生型。此外，300 mmol/L鹽脅迫期間轉(zhuǎn)基因苜蓿的相對電導率、MDA和葉綠素含量以及SOD活性均優(yōu)于野生型；脅迫15 d后，轉(zhuǎn)基因苜蓿的相對電導率和MDA含量顯著低于野生型，而Ch1含量和SOD活性都顯著高于野生型。這些結(jié)果表明GsbZIP33和GsCBRLK基因在轉(zhuǎn)基因植株中的超量表達，有助于高鹽脅迫下植株維持質(zhì)膜的穩(wěn)定性、減輕膜脂的過氧化作用、降低葉綠體的結(jié)構(gòu)功能的損傷以及增強SOD活性，提高抗氧化能力，因而轉(zhuǎn)基因苜蓿具有較高