釀酒酵母Ras2蛋白的功能研究.pdf

1、RAS基因家族廣泛存在于包括酵母、果蠅及哺乳動(dòng)物在內(nèi)的真核細(xì)胞中。由于Ras基因與人類惡性腫瘤的產(chǎn)生極為相關(guān),所以受到極大的關(guān)注。酵母Ras蛋白參與cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),并由于其與多細(xì)胞生物Ras蛋白的高度保守性而被廣泛深入的研究。本論文的主要研究內(nèi)容是探討釀酒酵母Ras2蛋白在Ras/cAMP/PKA的反饋抑制調(diào)控中的作用。同時(shí),還對(duì)PKA活性與Ras2蛋白的膜定位及酵母細(xì)胞保持質(zhì)粒的能力的關(guān)系進(jìn)行了研究。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,帶

2、有顯性突變RMS2Val19質(zhì)粒的酵母細(xì)胞經(jīng)熱擊后發(fā)生質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。這種質(zhì)粒丟失現(xiàn)象與帶有該質(zhì)粒的酵母細(xì)胞中的高PKA活性相關(guān)。這可能是由于熱擊改變了細(xì)胞膜的通透性而使質(zhì)粒溢出,或者由于細(xì)胞響應(yīng)熱擊使HSE元件激活并誘導(dǎo)某種酶的表達(dá)或者活化,將非染色體形式存在的質(zhì)粒降解。
　　 釀酒酵母細(xì)胞中Ras2蛋白磷酸化位點(diǎn)的突變?nèi)笔沟檬茉嚲陮?duì)熱擊更加敏感,胞內(nèi)貯存糖原的含量降低,細(xì)胞穩(wěn)態(tài)cAMP水平及誘導(dǎo)的水平都較野生型細(xì)胞更高。實(shí)

3、驗(yàn)表明,Ras2Ala214蛋白結(jié)合GTP能力較野生型高,與其共Pulldown的Cdc25蛋白水平也較野生型高,Ras2-GTP水平與PKA活性負(fù)相關(guān),表明釀酒酵母PKA對(duì)cAMP通路的反饋抑制作用的機(jī)制之一是通過對(duì)Ras2蛋白的磷酸化修飾來實(shí)現(xiàn)的。磷酸化修飾作用對(duì)Ras2蛋白的細(xì)胞定位沒有可分辨的影響,而PKA活性的變化對(duì)Ras2蛋白的細(xì)胞定位有影響。上述結(jié)果表明,PKA對(duì)Ras2的磷酸化作用減弱Ras2與GTP的結(jié)合能力從而降低R

4、as2對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的激活作用,反饋抑制Ras-cAMP通路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,Cdc25p與Ras2-GTP有較強(qiáng)的結(jié)合能力。
　　 在甘油培養(yǎng)條件下野生型菌株胞內(nèi)Ras2-GTP及與之結(jié)合的Cdc25p水平較葡萄糖培養(yǎng)條件下高,SCH9缺失則降低Ras2-GTP水平,表明在甘油培養(yǎng)條件下,SCH9抑制PKA活性,這與其在葡萄糖存在的完全培養(yǎng)條件下作用相反。
　　 兩個(gè)不同的Ras蛋白對(duì)該信號(hào)通路的影響不同,Ras2蛋白