釀酒酵母新的DNA復制起始蛋白的篩選.pdf

1、目前已被發(fā)現(xiàn)的復制起始蛋白大約有20個,但是DNA復制起始的機制仍然不夠清楚.對于釀酒酵母新的DNA復制起始蛋白的篩選與研究,將有助于DNA復制起始機制的深入理解和真核生物復制調控過程的全面闡明.該論文著重介紹一個新的酵母DNA復制起始蛋白的篩選方法.出發(fā)菌株經(jīng)過甲乙硫醚(EMS)誘變之后,如果復制相關基因功能部分缺失,將導致酵母體內只含有一個ARS的質粒無法正常復制而在酵母細胞分裂過程中丟失;但是由于酵母染色體上存在有多個復制起始位點

2、,復制起始頻率的降低并不影響其整個基因組的完全復制.這種質粒的丟失,可以通過增加質粒復制起始序列ARS的數(shù)量得以挽救.同時,酵母染色體有絲分裂相關基因的突變,也會引起酵母體內質粒的丟失,但這種突變所引起的質粒丟失無法通過增加質粒ARS的數(shù)量來挽救.在該篩選中,p1ARS(含1個ARS)和p8ARSs(含8個ARS)被用來區(qū)別這兩種突變.篩選得到復制起始突變株后,17個帶有已知復制起始基因的質粒,被分別轉化到這些突變株中,用以排除已知基因

3、的突變.最后,用YCp50構建的酵母基因組文庫來克隆未知的新基因.該方法通過酵母菌落顏色表型的變化,來篩選具有復制起始缺陷的突變株.ade2的酵母突變株會在菌體內積累紅色中間代謝產物,菌落顯紅色;ade2 ade3突變株的酵母菌落則呈白色,因為在腺嘌呤的生化合成途徑中,ADE3位于ADE2的上游,ADE3的突變使得紅色代謝物無法產生.當ade2 ade3突變株體內含有帶ADE3基因的質粒,其菌落在選擇性平板上則又顯紅色.而在非選擇性平板

4、上,野生型酵母體內質粒的丟失率很低,因而酵母菌落紅色的比例很高;在復制起始缺陷的突變株中,質粒的高度丟失使得酵母菌落大部分呈現(xiàn)白色.這種菌落顏色表型的變化,為全面大規(guī)模篩選新的復制起始蛋白提供了方便.到目前為止,該篩選從178000個EMS誘變的酵母菌株中,得到464個質粒高丟失候選菌株.通過用p1ARS和p8ARSs進行二級篩選,得到136個質粒高丟失菌株,其中有70個復制起始突變株和66個有絲分裂突變株.經(jīng)過進一步用已知起始基因的三