硫磺礦硫化葉菌Orc1-Cdc6蛋白在DNA復制起始中的調(diào)控功能研究.pdf

1、DNA復制是生命現(xiàn)象最本質(zhì)的內(nèi)容，是由眾多蛋白共同參與的能確保遺傳信息精確及時傳遞的復雜的生物學過程。古菌是一類區(qū)別于真核生物與真細菌的第三域生命形式，最近的研究表明它們的DNA復制系統(tǒng)與真核生物類似，而且更為簡單。因此，對古菌DNA復制的研究能夠為最終闡明高等真核生物復雜的DNA復制機制提供重要線索。
　　 Cdc6和MCM是與真核生物DNA復制起始有關(guān)的兩種蛋白。已經(jīng)報道極端嗜熱古菌硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus so

2、lfataricus)的環(huán)狀染色體含有三個活性復制原點，其基因組編碼三個Orc1/Cdc6同源蛋白(SsoCdc6-1、-2和-3)和一個MCM復制性解旋酶同源蛋白(SsoMCM)。盡管硫化葉菌有巨大潛力作為一種模式菌株來研究真核生物的重要復制機制，但目前有關(guān)古菌和真核生物復制起始蛋白如何介導原點DNA的解鏈以及復制起始復合物形成等有關(guān)的分子細節(jié)還很不清楚。本研究依據(jù)硫磺礦硫化葉菌兩個復制原點oriC1和oriC2的結(jié)構(gòu)特征，設計了三組

3、分別具有平端和分叉結(jié)構(gòu)的特異性DNA底物，通過EMSA、細菌雙雜交以及Pull-down/western blot等試驗，對S. solfataricus三個Orc1/Cdc6同源物之間以及它們與MCM、polB1和SSB之間的物理和功能相互作用進行了系統(tǒng)的研究，主要取得了的以下四個方面的研究結(jié)果：
　　 1.三個SsoCdc6差異性結(jié)合原點特異性DNA分子：SsoCdc6-1和-3不僅以結(jié)構(gòu)特異性而且以序列特異性方式結(jié)合原點D

4、NA底物。SsoCdc6-1對oriC1起源的DNA底物有較高的結(jié)合活性，對其平端底物的結(jié)合能力略高于分叉底物。SsoCdc6-3對oriC2起源的兩種結(jié)構(gòu)的DNA底物都有較高的結(jié)合活性，低濃度下結(jié)合分叉底物的能力高于平端底物，高濃度下沒有明顯的差異。而SsoCdc6-2對于三組DNA底物的結(jié)合活性沒有表現(xiàn)出明顯的序列特異性，但總體對平端底物的結(jié)合能力低于分叉結(jié)構(gòu)DNA。另外，利用EMSA實驗分析我們發(fā)現(xiàn)三個SsoCdc6 C-末端WH

5、結(jié)構(gòu)域缺失的突變體在體外也能結(jié)合原點特異性DNA底物，但是比全長的蛋白結(jié)合能力明顯減弱。我們推測不僅SsoCdc6 C-端WH結(jié)構(gòu)域，N-端結(jié)構(gòu)域和DNA序列也會影響它們結(jié)合DNA的能力。
　　 2.三個SsoCdc6可以通過其N-端催化結(jié)構(gòu)域發(fā)生物理和功能相互作用并且這種相互作用對它們的原點DNA結(jié)合活性有調(diào)控作用：細菌雙雜交和Pull-down/westernblot實驗表明三個SsoCdc6之間可以通過其N-端結(jié)構(gòu)域相互作

6、用；EMSA試驗表明SsoCdc6-1刺激SsoCdc6-3原點DNA結(jié)合活性，而且三者可能形成較大的SsoCdc6-1/SsoCdc6-3/DNA復合物。相反SsoCdc6-3和SsoCdc6-1都分別抑制SsoCdc6-2的DNA結(jié)合活性，而且SsoCdc6-1能和SsoCdc6-2相互作用形成大的SsoCdc6-1/SsoCdc6-2/DNA復合物。這些結(jié)果表明這些復制起始蛋白可能在功能上相互作用并調(diào)控彼此在原點上的集結(jié)，作為預復

7、制復合體(Pre-RC)的組件共同發(fā)揮作用來調(diào)控DNA復制的起始。
　　 3.三個SsoCdc6通過不同的結(jié)構(gòu)域和SsoMCM相互作用，并且這些相互作用在調(diào)控SsoMCM募集到原點DNA過程中起著重要的作用：細菌雙雜交和Pull-down/western blot以及EMSA實驗表明SsoCdc6-2通過其C-端結(jié)構(gòu)域和SsoMCM相互作用，并促進SsoMCM加載到原點DNA上。相反，SsoCdc6-1和-3通過其N-端結(jié)構(gòu)域和

8、MCM相互作用，并抑制SsoMCM和原點DNA的結(jié)合。雖然三個SsoCdc6蛋白都可以和SsoMCM解旋酶相互作用，相對SsoCdc6-1和-3，SsoCdc6-2和SsoMCM的相互作用要更緊密一些，并可能在解旋酶加載方面起作用。
　　 4.細菌雙雜交分析S.solfataricus Cdc6、DNA聚合酶polB1、MCM以及SSB之間的物理相互作用，結(jié)果表明：SsoCdc6-1△C/SsopolB1、SsoCdc6-3/S

9、sopolB1、SsoCdc6-2/SsoSSB、SsoCdc6-3/SsoSSB、SsoSSB/SsoMCM、SsopolB1/SsoMCM和SsopolB1/SsoSSB之間存在物理相互作用。
　　 總結(jié)以上研究結(jié)果我們推測，S.solfataricus三個SsoCdc6在DNA復制早期過程中可能扮演不同角色，但它們之間能夠相互協(xié)作共同調(diào)控DNA復制原點的起始。編碼SsoCdc6-1和SsoCdc6-3的基因分別與復制原點o