硫化葉菌CRISPr-Cas Cmrα系統(tǒng)體內(nèi)核酸干涉功能的研究.pdf

1、CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and their associated genes)是一種原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)，分布于約40％細(xì)菌和90％古菌中。CRISPR的特征是，來(lái)自外源核酸的各種間隔序列(spacer)將重復(fù)序列(repeat)分開(kāi)。根據(jù)Cas復(fù)合體的核心蛋白結(jié)構(gòu)的差別，CRISPR-Cas可分為2類(lèi)6型19種亞型。C

2、RISPR-Cas行使免疫功能分為三個(gè)步驟:獲取外源DNA作為間隔序列(Spacers);轉(zhuǎn)錄CRISPR并加工成成熟的crRNA;通過(guò)含有Spacer的成熟CRISPR RNA(crRNA)與外源核酸的堿基配對(duì)，介導(dǎo)Cas復(fù)合體對(duì)目標(biāo)核酸切割、降解。然而，第三型(TypeⅢ，包括Cmr和Csm亞型)是唯一的既能切割外源DNA又能切割外源RNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)。現(xiàn)有研究表明Cmr或Csm復(fù)合物中crRNA與目標(biāo)mRNA堿基互補(bǔ)

3、配對(duì)后，激活Cas10亞基的DNA切割活性并切割由RNA聚合酶產(chǎn)生的ssDNA，目標(biāo)mRNA則被Cmr(Csm)復(fù)合物中Cmr4(Csm3)以6-nt為間隔切割。
　　雖然Type Ⅲ切割目標(biāo)核酸的機(jī)制有了較為徹底的研究，但是crRNA的長(zhǎng)度和Cmr復(fù)合物的完整性對(duì)RNA干涉效率的影響尚未報(bào)道，而且非Cmr復(fù)合物蛋白對(duì)Cmr復(fù)合物核酸干涉效率的影響也不確定。本文研究的對(duì)象冰島硫化葉菌(Sulfolobus islandicus)E

4、233S編碼兩型CRISPR-Cas系統(tǒng)，即Type Ⅰ-A，Type Ⅲ-B (Cmr-α和Cmr-β)。其中Type Ⅰ-A系統(tǒng)只有DNA干涉活性，Type Ⅲ-B Cmr-β系統(tǒng)只有RNA干涉活性，而Type Ⅲ-B Cmr-α兩者兼具。本文以冰島硫化葉菌Cmr-β系統(tǒng)缺失株(S.islandicus Δcmr-β)為出發(fā)菌株，開(kāi)展了一系列的遺傳學(xué)分析，獲得以下幾個(gè)方面的成果:
　　(1) 由于在98kb片段缺失菌株(Δ98

5、kb E233S)中互補(bǔ)核酸酶Csx1的基因能恢復(fù)Cmr-α系統(tǒng)的DNA干涉活性。于是檢測(cè)Δcmr-β菌株背景下獲得的csx1基因缺失株的核酸干涉活性，但發(fā)現(xiàn)csx1基因的缺失并不影響Cmr-α系統(tǒng)的核酸干涉活性。所以在缺失菌的98kb片段中還有其他基因影響Cmr-α系統(tǒng)的核酸干涉活性，如csm6，csxPIN 。
　　(2)Cmr-α復(fù)合體由Cmr-α 1-6共6個(gè)亞基組成。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Δcmr-β菌株背景下獲得的cmr6基因缺失株

6、的RNA干涉活性不變，表明該亞基的缺失并不影響Cmr-α系統(tǒng)的RNA干涉活性。
　　(3) 設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度spacer的mini-CRISPR(最簡(jiǎn)CRISPR陣列)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入Δcmr-β菌株中。通過(guò)檢測(cè)獲得的菌株的RNA干涉活性，發(fā)現(xiàn)能發(fā)生RNA干涉的最短spacer長(zhǎng)度為32bp(野生型為40nt)，過(guò)長(zhǎng)的spacer并不會(huì)影響Cmr-α系統(tǒng)的RNA干涉活性。
　　(4) 在mini-CRISPR質(zhì)粒的spacer上

7、設(shè)計(jì)不同的突變，并將其轉(zhuǎn)入Δcmr-β菌株中。通過(guò)檢測(cè)獲得的菌株的RNA干涉活性，發(fā)現(xiàn)spacer的第25bp到30bp的突變會(huì)嚴(yán)重影響Cmr-α系統(tǒng)的RNA干涉活性。因此推斷Cmr-α系統(tǒng)的種子序列在spacer的第25nt到30nt之間。
　　綜上所述，Cmr-α復(fù)合體在冰島硫化葉菌體內(nèi)的核酸切割時(shí)，Cmr-α復(fù)合體亞基Cmr6α和核酸酶Csx1是非必須的，但需要核酸酶的參與。而且過(guò)短的crRNA或種子序列不匹配，會(huì)直接導(dǎo)致R