硫化葉菌超表達(dá)載體構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、在硫化葉菌中同源表達(dá)、純化并分析各種重要蛋白質(zhì)的功能對(duì)于研究極端嗜熱古菌的生命活動(dòng)具有重要意義。本研究利用araS啟動(dòng)子和穿梭載體pEXA構(gòu)建硫化葉菌超表達(dá)載體pZC2,成功超表達(dá)了帶有C端6×His標(biāo)簽序列的DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白Mre11,并進(jìn)一步采用共純化法鑒定到Mre11蛋白的作用配體Rad50,并確定上述蛋白在高鹽濃度(500mM NaCl)下仍能形成MR復(fù)合體,表明該復(fù)合物在逆性條件下可能仍保持DNA斷鏈修復(fù)的功能。進(jìn)一步共

2、純化分析表明基因組DNA片段是MR復(fù)合體形成的必需條件,在缺乏基因組DNA片段的情況下古菌分子伴侶蛋白結(jié)合并可能保護(hù)Mre11。因此該表達(dá)系統(tǒng)能夠有效地應(yīng)用于鑒定蛋白質(zhì)的體內(nèi)作用網(wǎng)絡(luò)。
　　 本研究構(gòu)建的超表達(dá)載體不僅可以表達(dá)重要蛋白并研究重要蛋白功能與鑒定重要蛋白的體內(nèi)作用網(wǎng)絡(luò),還可以用于分析古菌翻譯起始元件Shine-Dalgamo的功能。古菌的翻譯機(jī)制比較類似細(xì)菌,但是古菌的翻譯因子又類似真核生物,有自己獨(dú)特的性質(zhì),故研究

3、古菌的翻譯機(jī)制對(duì)了解物種的進(jìn)化有重大幫助。迄今為止,直接在古菌體內(nèi)對(duì)翻譯起始元件Shine-Dalgarno的功能研究極少。本研究在超表達(dá)載體pZC2的基礎(chǔ)上構(gòu)建了硫化葉菌阿拉伯糖操縱子Ss03067基因上游序列中Shine-Dalgamo(GGTGTA)序列雙堿基突變的lacS酶活報(bào)告質(zhì)粒,即STlacS-pZC2、SDN1lacS—pZC2、SDN2lacS-pZC2、SDN3lacS—pZC2,并轉(zhuǎn)化硫化葉菌后檢測Shine-Da