rmlC反義RNA載體的構(gòu)建及表達.pdf

1、目的：結(jié)核病是危害人類健康的最嚴重的傳染病之一，自20世紀80年代起，已經(jīng)受到控制的結(jié)核病疫情再次抬頭。主要原因之一是耐多藥的結(jié)核分枝桿菌菌株的日益增加，而現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物不能有效地治愈結(jié)核病，導(dǎo)致結(jié)核病患者的死亡率顯著增加。因此，迫切需要研發(fā)有效的抗結(jié)核新藥。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病的病原體。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的細胞壁在其生存和增殖過程中起著重要的作用，并且細胞壁的組

2、成成分和結(jié)構(gòu)比較獨特，是理想的藥物作用的靶標。被分枝菌酸酯化的聚阿拉伯糖與聚半乳糖通過銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共價連接到肽聚糖分子上，以形成分枝桿菌細胞壁的核心結(jié)構(gòu)。銜接雙糖是一重要的連接結(jié)構(gòu)，破壞這一結(jié)構(gòu)，細胞壁的完整性將遭到破壞從而結(jié)核分枝桿菌不能生存。銜接雙糖中鼠李糖的糖基供體是dNTP-鼠李糖，四種酶(rmlB，rmlD，rmlA，rmlC)參與了由底物葡萄糖-1-磷酸合成dTDP-鼠李糖的過程，編碼這四種酶的

3、基因存在于結(jié)核分枝桿菌基因組中的不同位置。前期工作中，用基因敲除技術(shù)證明了rmlC是分枝桿菌必需生長基因。但是，當rmlC低表達時對結(jié)核分枝桿菌細胞壁的合成和細胞形態(tài)變化的影響還不清楚，需要進一步研究。 本論文的目的是構(gòu)建rmlC反義表達重組質(zhì)粒pMind-rmlC-AS。構(gòu)建pET29b-rmlC表達重組質(zhì)粒，表達并純化RmlC蛋白免疫小鼠，制備小鼠抗RmlC蛋白多克隆抗體。電轉(zhuǎn)化反義表達重組質(zhì)粒 pMind-rmlC-AS

4、到 Mcycobacterium．smegmatis mc<'2> 155(以下簡稱mc<'2>155)中，用不同濃度的四環(huán)素(Tetracycline，Tc)誘導(dǎo)其表達。對Tc誘導(dǎo)后RmlC蛋白的表達量進行檢測，進一步研究rmlC基因?qū)u垢分枝桿菌mc<'2>155細胞壁生長情況的影響，為抗結(jié)核藥靶標選擇提供理論支持。 本論文所獲得的結(jié)果： 1.rmlC反義RNA表達載體pMind-rmlC-AS的構(gòu)建從TIGR(h

5、ttp：//www．tigr.org/tdb/)的恥垢分枝桿菌me<'2>155基因組數(shù)據(jù)庫獲得Sm rmlC基因的核苷酸序列(606bp)。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計一對PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分別引入了BarnHI和NdeI限制性內(nèi)切酶位點。以me<'2>155基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)，擴增rmlC基因。將純化的PCR產(chǎn)物與pSTBlue 1連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細胞中，用限制性內(nèi)切酶Bam

6、HI和Ndel，XbaI鑒定出陽性重組質(zhì)粒，用測序引物T7 primer對pSTBlue 1-rmlC中的rmlC片段進行DNA宇列測定，將DNA測序結(jié)果與已知的rmlC基因進行比對分析，結(jié)果表明所克隆的rmlC DNA片段沒有堿基突變。用限制性內(nèi)切酶BamHI和NdeI酶切pSTBlue I-rmlC，回收與純化rmlC DNA片段后與pMind連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NdeI鑒定出陽性重組

7、質(zhì)粒。 2.表達載體pET29b-rmlC的構(gòu)建從http：//www．tigr．org/tdb/的數(shù)據(jù)庫中獲得rmlC基因的核苷酸序(606bp)。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計一對PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分別引入了NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點，以便將rmlC基因克隆到pET29b表達載體的NdeI和XhoI位點。以mc<'2>155基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)，擴增rmlC基因。將純化的rmlC基因與p

8、MD18-T載體進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaBlue菌株的感受態(tài)細胞中。用藍白斑篩選法選出陽性菌落，用限制性內(nèi)切酶XhoI、SacI和XhoⅠ、HindⅢ鑒定出陽性重組質(zhì)粒pMD18-rmlC。用RV-M和M13-47測序引物對pMD18-rmlC中的rmlC片段進行DNA序列測定，結(jié)果表明所克隆的rmlC基因的核苷酸序列有一個突變，翻譯成氨基酸后再次進行比對，氨基酸序列完全一致。用NdeI和XhoI雙酶切pMD18-rm

9、lC陽性重組質(zhì)粒，回收并純化rmlC DNA片斷后，與表達載體pET29b連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaBlue感受念細胞中。用菌落PCR和NdeI、XhoI雙酶切方法鑒定重組表達載體pET29b-rmlC，表達載體中的rmtC基因產(chǎn)物的N端與pET29b載體上的6個連續(xù)的組氨酸標記形成融合蛋白，便于目的蛋白的檢測和純化。 3．RmlC蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達、純化和鑒定將質(zhì)粒pET29b-rmlC轉(zhuǎn)化

10、到大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細胞中，在37℃，用1mM IPTG誘導(dǎo)表達4小時。超聲破碎誘導(dǎo)的BL21(DE3)，對上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明RmlC蛋白在BL21(DE3)中表達。將100ml誘導(dǎo)后的BL21(DE3)大腸桿菌懸浮在5 ml Lysis Prep Buffer中，用超聲方法破碎細胞后，在4℃離心 12，000g 20分鐘，取上清。加入Ni-NTA柱，用20 ml Lysis Prep

11、Buffer沖洗，再用20 ml Wash Buffer沖洗，除去未于Ni-NTA柱結(jié)合的蛋白。用10 ml的Elute Buffer洗脫，收集前5 ml洗脫液，每個EP管收集15滴。 樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，用抗多聚組氨酸的單克隆抗體及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗進行檢測，結(jié)果表明，所檢測到的蛋白質(zhì)的分子量與預(yù)期的融合蛋白分子量一致，所表達的蛋白為rmlC基因產(chǎn)物4．抗RmlC蛋白抗體的制備

12、、抗體效價的測定及鑒定以純化的重組RmlC蛋白BALB/C小鼠，末次免疫一周后經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血，分離血清56℃滅活30 min，-70℃凍存。采用間接ELISA法測定效價，當稀釋度為1∶6400時仍為陽性。用Western印跡鑒定小鼠抗RmlC蛋白多克隆抗體。結(jié)果表明制備的抗體具有較高的效價和特異性。 5．rmlC反義RNA在恥垢分枝桿菌mc<'2>155中的表達電轉(zhuǎn)化pMind-rmlC-AS到mc<'2>155 感受態(tài)細胞中

13、。分別測定mc<'2>155/pMind-rmlC-AS菌株和mc<'2>155菌株在Tc分別為0 ng/ml，10ng/ml，20 ng/ml，50 ng/ml和100 ng/ml條件下的生長曲線，結(jié)果表明，在未達到48小時前，mc<'2>155/pMind-rmlC-AS 菌株的生長速度明顯低于mc<'2>155菌株。當Tc濃度為10 ng/ml和20 ng/ml時，在生長36小時時，兩者菌密度差異最大。 我們分別將100

14、 ml mc<'2>155/pMind-rmlC-AS菌株和mc<'2>155菌株在Tc濃度為10 ng/ml和20 ng/ml條件下培養(yǎng)36小時，用超聲方法破碎細胞后，取上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，用制備的鼠抗RmlC蛋白多克隆抗體及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗進行檢測，結(jié)果顯示在Tc濃度分別為10 ng/ml和20 ng/ml條件下，mc<'2>155/pMind-rmlC-AS菌株和mc<'2>15

15、5菌株中RmlC蛋白表達量并無明顯差異。因此，需要進一步優(yōu)化Tc對mc<'2>155/pMind-rmlC-AS菌株的誘導(dǎo)條件，以產(chǎn)生更多的rmlC反義RNA分子。 結(jié)論：在本研究中，我們以mc<'2>155基因組DNA為模板，用PCR的方法擴增出正確的rmlC DNA。構(gòu)建了pMind-rmlC-AS反義表達載體。構(gòu)建了pET29b-rmlC表達載體。表達并純化了RmlC蛋白。用純化的RmlC蛋白免疫BALB/C小鼠，制備了