hADRB1表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文hADRB1表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用姓名：杜林申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：賴(lài)立輝20070501華東師范丈學(xué)碩士論文分子與化學(xué)生物學(xué)研究所hADRBl表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究生：杜林指導(dǎo)老師：賴(lài)立輝中文摘要：【目的】腎上腺素能受體(AdrenergicreceptorAR)是典型的G蛋白偶聯(lián)受體家族(OPCR)成員。介導(dǎo)交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素的中

2、樞和外周作用，它在心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)如血壓、心率、心肌收縮、物質(zhì)代謝等方面具有十分重要的地位。B受體和G蛋白偶聯(lián)調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性。刺激B受體增加胞內(nèi)cAMP的水平，而阻斷B受體則降低胞內(nèi)cAMP的水平。因此，刺激或阻斷B受體可調(diào)節(jié)PKA和／或MAP激酶(MAPK)的活性，從而調(diào)節(jié)核內(nèi)特異cAMP反應(yīng)因子結(jié)合蛋白(cREB)的活性，引起特異的生物學(xué)效應(yīng)。既往實(shí)驗(yàn)證明，杏仁復(fù)合體B受體參與調(diào)控LTP和條件性恐懼記憶，大鼠海馬CAl區(qū)13

3、受體參與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和空間學(xué)習(xí)。目前對(duì)B腎上腺素受體功能及機(jī)制的研究主要是通過(guò)生理學(xué)的研究方法，注射藥物——觀(guān)察整體——推測(cè)功能。而我們則從基因功能研究角度出發(fā)，構(gòu)建ADRBl上調(diào)、下調(diào)載體，包裝成重組腺相關(guān)病毒載體，并最終制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以觀(guān)察由于Bl腎上腺素受體表達(dá)量的改變所引起的生物學(xué)、行為學(xué)效應(yīng)，以此研究BI腎上腺素受體在學(xué)習(xí)和記憶中的作用?！痉椒ā?采用基因過(guò)表達(dá)方式，構(gòu)建ADRBI上調(diào)載體。2采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建ADRBl

4、下調(diào)載體。3根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、流式細(xì)胞術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果篩選出包裝病毒的候選載體。4利用AAVHelperfreesystem生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒。5采用一步柱純化法和“氯仿處理PEG／NaCI沉淀氯仿抽提”法，對(duì)病毒的初級(jí)產(chǎn)物進(jìn)行濃縮和純化。6通過(guò)表達(dá)載體所攜帶的綠色熒光測(cè)定重組腺相關(guān)病毒的滴度?！窘Y(jié)果】1構(gòu)建了hADRBl上調(diào)、下調(diào)表達(dá)載體，并通過(guò)了酶切鑒定，細(xì)胞轉(zhuǎn)染、流式細(xì)胞術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的驗(yàn)證。2包裝并純化了含hADR