骨保護(hù)素植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的：構(gòu)建骨保護(hù)素植物表達(dá)載體pZP211-Ubi-opg，將pZP211-opg轉(zhuǎn)入優(yōu)良玉米自交系昌7-2和18-599，以玉米作為生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)骨保護(hù)素。
　　 方法：opg位于克隆載體pMD18-T的EcoRV處，兩端設(shè)計帶有BamH I和Sac I酶切位點的引物，提取的含pMD18-T的大腸桿菌的質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增的模板擴(kuò)增opg序列，用BamH I和Sac I分別雙酶切表達(dá)載體pZP211和擴(kuò)增產(chǎn)物，回收大小片段并

2、連接，將opg定向克隆到表達(dá)載體pZP211 Ubi啟動子的下游，經(jīng)酶切、PCR以及測序驗證克隆正確。以優(yōu)良玉米自交系昌7-2和18-599誘導(dǎo)出的愈傷組織為試材，通過基因槍轟擊法完成了pZP211-Ubi-opg基因的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的愈傷組織經(jīng)巴龍霉素(25mg/L、50mg/L、25mg/L)三輪篩選后分化成抗性苗，通過PCR、RT-PCR分子檢測獲得了轉(zhuǎn)基因植株。
　　 結(jié)果：通過PCR方法將目的基因opg從克隆載體pM

3、D18-T上擴(kuò)增出來，利用酶切和連接技術(shù)成功將目的基因與表達(dá)載體連接，構(gòu)建了人opg的植物表達(dá)載體pZP211-Ubi-opg；通過基因槍轟擊法將該表達(dá)載體成功地導(dǎo)入玉米自交系18-599和昌7-2的愈傷組織中，經(jīng)篩選分化獲得抗性苗；分子檢測初步證明opg已整合入玉米基因組中。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pZP211-Ubi-opg，完成了玉米的遺傳轉(zhuǎn)化，初步檢測確定目的基因已整合到玉米基因組中，獲得了含opg的18-5