納豆激酶植物表達(dá)載體的構(gòu)建及番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、　　番茄是世界上栽培最廣泛，年產(chǎn)量最高的蔬菜作物之一，也是遺傳學(xué)和生物工程等學(xué)科研究中的重要對(duì)象和模式植物，其研究結(jié)果常常被借鑒用于其他作物上。截至1997年底，全世界共有48個(gè)轉(zhuǎn)基因番茄品種進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。目前，利用番茄作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)植物疫苗、基因工程藥物和功能食品的研究正成為番茄基因工程研究的一個(gè)熱點(diǎn)。而納豆激酶是一種由納豆枯草桿菌(Bacillusnatto)產(chǎn)生的具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，其來源于日本的傳統(tǒng)食品－納豆(na

2、tto)。國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果表明，納豆激酶(NattokinaseNK)可有效地分解血栓的主要成分——纖維蛋白，極有可能開發(fā)成為新一代理想的溶栓藥物。因此，本試驗(yàn)旨在建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系，為用植物作為生物反應(yīng)器來獲取納豆激酶蛋白提供一條新途徑，主要研究結(jié)果如下：　　1.根據(jù)GeneBank里公布的納豆激酶基因序列設(shè)計(jì)引物，并分別在兩端增加了BamHI酶切位點(diǎn)，利用納豆芽孢桿菌菌液進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過試劑盒回收純化提

3、取NK基因，并和PBST載體連接，從而成功地克隆到了納豆激酶基因；測(cè)序結(jié)果表明，克隆的NK基因大小為1143bp，共編碼381個(gè)氨基酸，其與GeneBank中報(bào)道的序列(AF368283)同源性達(dá)到99.7﹪以上，產(chǎn)生突變的3個(gè)堿基，并沒有影響到納豆激酶的纖溶活性?！　?.利用質(zhì)粒pBPC47、質(zhì)粒pCAMBIA1300和質(zhì)粒pMG15進(jìn)行納豆激酶基因NK表達(dá)載體的構(gòu)建。PCR反應(yīng)和酶切檢測(cè)證明，目的基因片段正向插入載體pCAMBIA

4、1300，從而成功的構(gòu)建了表達(dá)載體pCAMBIA-nk?！　?.采用經(jīng)典凍融法轉(zhuǎn)化pCAMBIA-nk表達(dá)質(zhì)粒，將其導(dǎo)入到農(nóng)桿菌LBA4404中；并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)作用，將質(zhì)粒pCAMBIA-nk導(dǎo)入番茄，通過潮霉素篩選得到了大量的抗性愈傷組織，并進(jìn)一步進(jìn)行分化、生根、煉苗培養(yǎng)，最終得到了7株再生番茄苗，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到7.52‰。　　4.以載體質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化植株DNA為陰性對(duì)照，對(duì)得到的再生植株進(jìn)行PCR反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果表