地黃高頻再生體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步研究.pdf

1、地黃是我國著名的傳統(tǒng)大宗中藥材，為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosaLibosch．)的新鮮或干燥塊根。具有清熱、滋陰、涼血、生津、補血、益精等功效，和調(diào)節(jié)免疫功能，改善心血管系統(tǒng)、造血系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)，抗腫瘤，抗衰老及降血糖等藥理活性，應(yīng)用廣泛，具有重要的臨床價值。由于地黃長期進行無性繁殖，因此，品種退化是地黃生產(chǎn)中存在的主要問題，常規(guī)的方法不能對此進行根治。對此，數(shù)十年來，不少科研人員在不同層次上作了一些探討和研

2、究，標(biāo)明導(dǎo)致地黃品種退化的根本原因是病毒的感染。近年來，我們對河南、山東地黃產(chǎn)區(qū)的病毒病原進行了鑒定研究，表明地黃的主要病毒病原為TMV和CMV，并對利用基因工程技術(shù)防治地黃病毒病進行了初步探索，但未取得實質(zhì)性的進展。針對上述情況，我們認(rèn)為地黃的再生頻率不夠高、基因轉(zhuǎn)化體系尚不完善是轉(zhuǎn)化失敗最主要的兩個原因。因此，本文即在前人的工作基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化了以葉片為外植體的再生體系，并在高頻再生的條件下建立地黃的遺傳轉(zhuǎn)化體系。 本論文

3、的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1、成功建立并優(yōu)化了2種地黃再生系統(tǒng)，即愈傷組織再生系統(tǒng)和葉片叢生芽誘導(dǎo)系統(tǒng)。 (1)本文應(yīng)用正交實驗優(yōu)化地黃愈傷組織再生體系。 本研究選取L<,27>(3<'13>)正交設(shè)計表為實驗方案，以愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織化分級、生長率、生根率、出芽率為指標(biāo)，運用極差分析、多因素方差分析、多重比較、均值分析等多種統(tǒng)計學(xué)手段對以上指標(biāo)進行分析，評價2,4-D、NAA和6-BA三種植物激素對愈傷

4、組織質(zhì)量的影響。 具體方法為：將葉片分別接種于MS附加不同種類和濃度激素的27組培養(yǎng)基上，進行愈傷組織誘導(dǎo)。暗培養(yǎng)20天后，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織化級數(shù)、生長率。為了評價不同形態(tài)、質(zhì)地的愈傷組織的分化能力，暗培養(yǎng)后把全部外植體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS+IAA(0.1mg/L)+6-BAmg/L(3.0mg/L)，光培養(yǎng)30天后統(tǒng)計生根率和出芽率。 取得如下結(jié)果： ①愈傷組織誘導(dǎo)率：6-BA影響顯著，NAA、2,4

5、-D影響不顯著；當(dāng)6-BA2.0mg/L時可獲得最大愈傷組織誘導(dǎo)率； ②愈傷組織化分級：2,4-D和6-BA交互作用影響極顯著，單因子6-BA影響顯著，而2,4-D和NAA影響不顯著；2,4-D 0.1mg/L、6-BA 2.0mg/L時可獲得最大愈傷組織化分級；③生根率：2,4-D、6-BA影響極顯著，NAA影響不顯著；當(dāng)2,4-D 1.0mg/L、6-BA2.0mg/L時不定根分化最少； ④出芽率：2,4-D、NAA

6、及兩者的交互作用影響顯著，6-BA影響不顯著；當(dāng)2,4-D 0mg/L、NAA 0.5mg/L時出芽率最大； ⑤生長率：2,4-D影響極顯著，NAA和2,4-D交互作用影響顯著；當(dāng)2,4-D0mg/L和NAA 0.5mg/L時生長率最大。 通過以上的分析，確定優(yōu)化的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+NAA(0.5mg/L)+6-BA(2.0mg/L)，再生率達90％以上，為地黃再生體系的進一步優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。 (2)建立

7、并優(yōu)化了地黃葉片叢生芽途徑： ①以MS+6-BA(2、3、4mg/L)+IAA(0.1mg/L)討論了不同細胞分裂素/生長素比例對地黃葉片再生的影響，以生長率和出芽率為評價指標(biāo)，經(jīng)單因素方差分析和均值分析，結(jié)果表明MS+6-BA(4mg/L)+IAA(0.1mg/L)即細胞分裂素/生長素40倍比例為優(yōu)化的葉片叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。 ②以MS+6-BA(4.0mg/L)+IAA(0.1mg/L)+AgNO<,3>(0、5、10

8、、15、20mg/L)為培養(yǎng)基，討論AgNO<,3>對地黃葉片及葉主脈叢生芽誘導(dǎo)的影響，以生長率和出芽率為考查指標(biāo)，經(jīng)單因素方差分析和均值分析，結(jié)果表明葉片的最適硝酸銀濃度是5mg/L以下，葉脈在5～10mg/L之間。 ③以MS+NAA(0.1mg/L)+6-BA(4mg/L)+CH(0、0.5、1、2、3 mg/L)為培養(yǎng)基，討論水解酪蛋白對地黃葉片叢生芽誘導(dǎo)的影響，實驗證明當(dāng)其濃度高于0.5mg/L時對葉片產(chǎn)生毒害作用，不利

9、于生長和分化。 2、初步建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的地黃遺傳轉(zhuǎn)化體系本研究利用LBA4404/pCAMBIA 1305對地黃的葉盤進行了轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)化體系進行了摸索，獲得了GUS基因的瞬時表達，初步建立了根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化體系。 (1)以地黃的生根情況摸索地黃對潮霉素的耐受限度。在MS培養(yǎng)基中添加Hpt(0、2、3、4、5mg/L)，通過生根敏感性實驗，確定了生根篩選濃度為4mg/L。 (2)在葉片叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+

10、6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L)中加入羧芐青霉素，使培養(yǎng)基內(nèi)所含的Cb濃度分別為0mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L。以出芽率和生長率為考查指標(biāo)，說明Cb的添加極大的阻礙了葉片的生長和分化過程。 (3)通過觀察根癌農(nóng)桿菌LBA4401在YEB添加200、300、400、500mg/L羧芐青霉素的培養(yǎng)基中的生長情況，測量抑菌圈的大小，確定了最低的抗生素濃度為200mg/L。

11、 (4)適當(dāng)?shù)那秩緯r間是獲得理想轉(zhuǎn)化效果的前提，通過統(tǒng)計GUS基因的瞬時表達率，證明5～10分鐘比較適合葉盤的侵染。 (5)硝酸銀的加入可提高轉(zhuǎn)化葉盤的叢生芽誘導(dǎo)率。 (6)AS的加入有利于提高抗性不定芽的誘導(dǎo)率。 上述研究完善了懷地黃“85-5”離體培養(yǎng)體系，明確了三種植物激素對地黃葉片再生的影響及可能的機理，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)初步建立了地黃的轉(zhuǎn)化體系。這些結(jié)果為地黃外源目的基因的轉(zhuǎn)化和品質(zhì)改良奠定了基礎(chǔ)，