石榴不同外植體再生體系建立及遺傳轉(zhuǎn)化體系初探.pdf

1、石榴屬于石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）果樹(shù)。據(jù)研究報(bào)道，其果實(shí)含有較高抗氧化物質(zhì)，對(duì)于心血管疾病、癌癥具有明顯的預(yù)防和治療作用。石榴耐旱、耐瘠薄、耐粗放管理，花果共賞，因此，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值。
　　石榴的品種很多，‘突尼斯軟籽’石榴是目前我國(guó)栽培石榴中種皮最軟的品種，早果豐產(chǎn)，果實(shí)外觀艷麗，籽大粒甜，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。但近年來(lái)栽培發(fā)現(xiàn)，‘突尼斯軟籽’石榴耐寒性較差，制約著其在生產(chǎn)

2、中的推廣和應(yīng)用。
　　果樹(shù)常規(guī)育種效率低，耗時(shí)長(zhǎng)，很難獲得期望的新種質(zhì)，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)為快速培育抗寒石榴新種質(zhì)提供了可能。本試驗(yàn)采用‘突尼斯軟籽’石榴上胚軸、下胚軸、子葉為外植體，比較不同外植體間再生能力的差異，建立高效穩(wěn)定的再生體系，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行ICE1抗寒基因的遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究，為通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化培育抗寒新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.消毒處理：8月中旬前采用整果消毒法，自來(lái)水沖洗1 h，75％酒

3、精處理30 s；8月中旬后采摘的果實(shí)對(duì)種子進(jìn)行消毒，具體方法是5%NaClO處理30 min；成熟后采收并貯藏至第二年的果實(shí)采用1% HgCl2處理種子8 min。
　　2.催芽處理：5%NaClO浸泡15 min，25±2℃催芽7 d，既可使初始萌發(fā)提前至接種后20 d，又可提高萌發(fā)率，萌發(fā)率為62.67%。
　　3.胚培養(yǎng)：5%NaClO浸泡種子15 min后，25±2℃催芽7 d，接種到MS+3.0 mg/LGA3培養(yǎng)

4、基上進(jìn)行培養(yǎng)效果最好，接種后23 d即可萌發(fā)，種胚萌發(fā)率高達(dá)86.67%，上胚軸長(zhǎng)度增幅為0.5-1.0 cm。
　　4.上胚軸切段再生不定芽：不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基MS+0.5 mg/LNAA+1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/LKT+1.0g/LPVP，出愈率和不定芽誘導(dǎo)率均最高，分別為92.22%和71.11%。
　　5.下胚軸切段再生不定芽：不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基MS+0.5 mg/LNAA+1.0 mg/L6-B

5、A+1.0 mg/LKT+1.0g/LPVP，出愈率和不定芽誘導(dǎo)率均最高，分別為95.56%和81.11%。
　　6.子葉再生不定芽：子葉取自培養(yǎng)60 d的健壯植株，橫切2-3刀，接種至MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/LKT+1.0g/LPVP培養(yǎng)基中，出愈率高達(dá)78.89%，不定芽誘導(dǎo)率為37.78%。
　　7.不定芽再生根：3種外植體均適用于1/2MS+0.1 mg/LNAA+0.

6、5 g/LAC+1.0 g/LPVP生根培養(yǎng)基，其中，子葉生根效果最好。
　　8.不同外植體再生能力：下胚軸>上胚軸>子葉。
　　9.不同外植體對(duì)農(nóng)桿菌侵染耐受性：3種外植體均進(jìn)行抗寒基因ICE1的轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)3 d后部分上胚軸和下胚軸褐化，選擇培養(yǎng)10-15 d后上胚軸全部褐化死亡，下胚軸大部分褐化，子葉無(wú)褐化現(xiàn)象，且培養(yǎng)45 d后形成抗性芽。初步得出‘突尼斯軟籽’石榴三種不同外植體對(duì)農(nóng)桿菌侵染耐受性強(qiáng)弱為：子葉＞下胚軸＞