燕麥遺傳轉化體系的建立和披堿草再生體系的建立.pdf

1、本文擬研究燕麥(Oat)的組織培養(yǎng)及其植株再生，建立它們的遺傳轉化體系，通過根癌農桿菌EHA105介導，把來自類產堿假單胞菌的殺蟲毒蛋白基因PPIP轉入燕麥，培育出具有抗蟲能力的牧草新材料；研究短芒披堿草(Elymus breviarjstatus)的組織培養(yǎng)及其植株再生，為將PPIP基因轉入短芒披堿草作好準備。 建立了短芒披堿草的胚性愈傷組織誘導和再生體系。研究結果表明：外植體來源，和植物生長調節(jié)劑組合等是影響愈傷組織誘導和植

2、株再生的主要因素。分析比較了短芒披堿草成熟胚，下胚軸和幼葉三種來源的外植體，其中成熟胚的出愈率最高，平均達到了47.82％。短芒披堿草愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，最佳的激素組合為5mg/L 2,4-D+0.05mg/L KT+2mg/LABA。同時發(fā)現(xiàn)添加1mg/L 左右的酪蛋白水解液能夠明顯提高愈傷組織的生長質量，可以改善愈傷組織的質量，提高愈傷組織的分化能力。繼代培養(yǎng)時間對愈傷組織的分化有很大影響。從成熟胚誘導的愈傷組織

3、分化能力最強，可以達到48％左右。短芒披堿草最佳分化培養(yǎng)基是1/2MS基本培養(yǎng)基無機鹽+B5有機物+NAA0.5mg/L+KT0.01 mg/L。 優(yōu)化了燕麥861再生體系：分析比較了該品種成熟胚，下胚軸和幼葉三種來源的外植體，其中成熟胚的出愈率最高，平均達到了64％。燕麥草愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，最佳的激素組合為4mg/L 2,4-D。從成熟胚誘導的愈傷組織分化能力最強，可以達到54.3％左右。燕麥最佳分化培養(yǎng)

4、基是1/2MS基本培養(yǎng)基無機鹽+B5有機物+0.1mg/LKT和1.0mg/L6-BA。建立了燕麥抗性愈傷組織的篩選方案。較好的篩選劑是潮霉素，45mg/L潮霉素濃度可較好的燕麥愈傷組織的篩選。確定使用成熟胚誘導出來的愈傷組織作為基因轉化的材料，并通過根癌農桿菌介導，把類產堿假單胞菌的殺蟲毒蛋白基因ppIP轉入繼代40d后的愈傷組織，用潮霉素篩選抗性愈傷組織，最后再生分化出抗性植株，篩選培養(yǎng)基配方為：MS+2,4-D5.0+KT0.05

5、+Hn45+Carb500。實驗所用質粒為PCAMBIAl304雙元載體，其上有kam，hpt，gus和mGFP等基因，用特定的酶切去gus和.mGFP基因，然后把殺蟲毒蛋白基因ppIP連接上去。構建好的質粒轉入根癌農桿菌EH105，然后浸染已經處理好的愈傷組織。農桿菌浸染后的愈傷組織培養(yǎng)在共培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)6d后，轉入篩選培養(yǎng)基篩選抗性愈傷組織，共培養(yǎng)基配方為：1/4MS+2,4-D5.0+80μMAS pH5.6最后通過PCR，RT