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1、利用大腸桿菌生產(chǎn)多肽類藥物具有成本低,周期短且不存在病毒致癌基因污染等優(yōu)點(diǎn),所以大腸桿菌是目前基因工程中細(xì)胞因子和多肽類藥物生產(chǎn)的主要工程菌。但大多外源基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)往往以包含體形式存在,這就造成復(fù)性的困難和成本的提高。原核生物表達(dá)系統(tǒng)缺乏真核細(xì)胞特有的加工后處理;高度還原環(huán)境大腸桿菌胞質(zhì)使表達(dá)的重組蛋白往往不能形成正確的二硫鍵與完整的四級(jí)結(jié)構(gòu)都使得重組蛋白的活性較低。因此如何獲得高效可溶性并具有類似天然生物活性的重組蛋白是利用
2、大腸桿菌進(jìn)行基因工程技術(shù)的關(guān)鍵。大腸桿菌胞間質(zhì)內(nèi)的Dsb(二硫鍵氧化還原酶)家族使得胞間質(zhì)內(nèi)氧化電勢(shì)較高為形成二硫鍵提供了有利條件。利用Dsb家族和目的蛋白融合表達(dá)具有讓外源蛋白周質(zhì)腔定位并輔助其正確形成二硫鍵和空間結(jié)構(gòu)的功能。 本課題基于以往的研究基礎(chǔ),利用Dsb蛋白家族的功能和特性構(gòu)建了串聯(lián)表達(dá)載體pET-SWG1-SWG2-NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基)和pET-SWG1-SWG2-C7+Fc(環(huán)七肽和Fc融合蛋白),并通過
3、優(yōu)化表達(dá)條件實(shí)現(xiàn)了融合蛋白SWG1-SWG2-NGF和SWG1-SWG2-C7+Fc在大腸桿菌中高效可溶性表達(dá)。伴侶蛋白和目的蛋白之間凝血酶位點(diǎn)酶切和再次分離純化后,獲得了具有較高生物活性的目的蛋白NGFβ亞基和G+Fc。 通過本課題研究,構(gòu)建了高效可溶性表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)NGFβ亞基和G+Fc在原核高效可溶表達(dá)并具有良好生物活性。這為實(shí)現(xiàn)其它細(xì)胞因子或多肽類藥物利用原核表達(dá)提供了模式。也為探討原核生物的表達(dá)機(jī)制提供參考。
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