小麥TaNCED1基因的表達(dá)載體構(gòu)建及功能分析.pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜缰匾Z食作物之一，在全球氣候變暖，各種極端天氣出現(xiàn)頻率同益增加的情況下，提高其對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性，保證小麥的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。脫落酸(ABA)作為一種在植物的整個(gè)生命循環(huán)中起著重要作用的激素，對(duì)種子的發(fā)育和休眠以及適應(yīng)各種外界環(huán)境的脅迫反應(yīng)的調(diào)控都有十分重要的作用。通過改變ABA生物合成路徑關(guān)鍵基因的、表達(dá)來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)ABA的水平是提高植物抗逆性一個(gè)重要途徑。 9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)催化9

2、-順式-紫黃質(zhì)或9-順式-新黃質(zhì)產(chǎn)生黃質(zhì)醛，被認(rèn)為是ABA合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶，并對(duì)ABA的合成調(diào)控起十分重要的作用。在干旱、高鹽等逆境條件下，NCED基因的表達(dá)可以提高植物體內(nèi)ABA的含量，增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的抗逆性。 本研究在已從小麥中克隆到三個(gè)TaNCED1基因(TaNCED1-2、-3、-7)的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建TaNCED1基因的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株在鹽和ABA脅迫條件下的表現(xiàn)進(jìn)行鑒定，初步

3、鑒定分析TaNCED1基因的功能及其多樣性。主要結(jié)果如下： 1、通過PCR的方法從克隆載體上擴(kuò)增獲得了三個(gè)目的基因，利用KpnI和XbaI兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物及表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S進(jìn)行雙酶切后連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B，篩選到含有目的基因的重組質(zhì)粒，構(gòu)建了三個(gè)TaNCED1的表達(dá)載體，并采用PCR和酶切的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，并將驗(yàn)證后的質(zhì)粒采用凍融法導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101中，完成表達(dá)載體的構(gòu)建

4、。 2、通過floral dip的方法將TaNCED1-2、TaNCED1-3、TaNCED1-7三個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入到擬南芥中，經(jīng)初步篩選分別得到13、24、45株具有Kan抗性的轉(zhuǎn)化苗，經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證共得到得到79株陽性轉(zhuǎn)化植株，陽性率為96.3％。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株T2、T3代繼續(xù)進(jìn)行PCR篩選，每個(gè)TaNCED1基因得到4個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系，分別命名為S21～S24、S31～S34、S71～S74。 3、對(duì)純合轉(zhuǎn)基因株系

5、S21、S31和S71進(jìn)行了ABA的敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明在沒有添加ABA的培養(yǎng)基上，S71和WT種子在萌發(fā)上存在顯著的差異，S21和S31的萌發(fā)也受到一定程度的影響但不如S71顯著。在添加0.5 μmol/LABA培養(yǎng)基上，S21、S71和WT之間差異顯著，S31的萌發(fā)和WT之間也有差異，但是不如而S21和S71明顯。以上結(jié)果表明TaNCED1基因的過量表達(dá)可能使種子內(nèi)的ABA的水平增高，延長(zhǎng)了種子的休眠，使種子萌發(fā)速率減慢。轉(zhuǎn)三個(gè)Ta

6、NCED1基因的株系存在一定程度的差別，可能與它們?cè)诠δ苌洗嬖谝欢ǖ牟顒e有關(guān)。 4、將S21、S71和WT的種子播種在含有不同濃度的NaCl培養(yǎng)基上，并對(duì)其表型進(jìn)行分析，結(jié)果表明隨著NaCl濃度的增加，轉(zhuǎn)基因株系S21和S71種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，在低濃度的NaCl脅迫下，過量表達(dá)TaNCED1的轉(zhuǎn)基因株系和WT之間直接存在明顯的差異。在高濃度的NaCl脅迫下，所有的種子萌發(fā)都受到抑制，但轉(zhuǎn)基因植株受到的抑制更加明