CRISPR-Cas系統(tǒng)對宮頸癌SiHa和Caski細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas系統(tǒng)對人宮頸癌細(xì)胞系SiHa和Caski細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：設(shè)計(jì)3個(gè)針對HPV16-E6基因的sgRNA，合成Cas9質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染SiHa（HPV16陽性）和Caski（HPV1

2、6和HPV18雙陽性）細(xì)胞，48小時(shí)后提取細(xì)胞DNA，進(jìn)行PCR，T7E1法檢測3種sgRNA是否能夠針對HPV16-E6基因的特定位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（double strand break，DSB）。同樣的轉(zhuǎn)染方法，再將sgRNA和Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SiHa、Caski和HEK293（HPV陰性）細(xì)胞，48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測其對這三種細(xì)胞系凋亡的影響。CCK8法檢測其對這三種細(xì)胞的細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響；Western Blot檢測

3、SiHa和Caski細(xì)胞系在處理后48小時(shí)E6蛋白及P53蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：T7E1酶切結(jié)果顯示，gRNA-1/Cas9不能作用于SiHa和Caski細(xì)胞產(chǎn)生DSB，gRNA-2/Cas9和gRNA-3/Cas9均可以導(dǎo)致SiHa和Caski細(xì)胞產(chǎn)生DSB；流式細(xì)胞儀檢測的凋亡結(jié)果顯示，gRNA-1/Cas9與空白對照的細(xì)胞凋亡情況一致，gRNA-2/Cas9和gRNA-3/Cas9可以導(dǎo)致SiHa和Caski細(xì)胞系凋亡

4、明顯增加，而gRNA-2/Cas9和gRNA-3/Cas9對HEK293細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡無明顯作用；CCK8法顯示的細(xì)胞增殖抑制的趨勢與細(xì)胞凋亡相同，即gRNA-2/Cas9和gRNA-3/Cas9轉(zhuǎn)染后的SiHa和Caski細(xì)胞的細(xì)胞增殖被抑制，gRNA-1/Cas9與空白對照組的細(xì)胞增殖狀態(tài)都無明顯變化；western Blot顯示在轉(zhuǎn)染了gRNA-2/Cas9和gRNA-3/Cas9實(shí)驗(yàn)組的SiHa和Caski細(xì)胞中，E6蛋白表達(dá)