一種新型的細菌體內(nèi)CRISPR-Cas9檢測系統(tǒng)的建立及其活性鑒定.pdf

1、目的：
　　CRISPR/Cas9是一種新型的基因編輯技術，其操作簡單、可對基因組特定位點進行切割，但存在一定的脫靶性，有待深入探討。本論文通過建立一種不受序列限制且酶切連接反應一步進行的分子克隆方法，構建Cas9蛋白在大腸埃希菌和恥垢分枝桿菌中的表達質(zhì)粒，同時構建在恥垢分枝桿菌中表達結核分枝桿菌ClpC2蛋白和mCherry熒光蛋白的質(zhì)粒；在此基礎上，構建一種在細菌體內(nèi)通過同源重組和具有同源臂的熒光報告基因mCherry對Cas

2、9蛋白及不同的guide RNA設計對靶標序列的切割效率、脫靶效應等的檢測系統(tǒng)。為后續(xù)深入研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應、guide RNA的設計及其生物學應用奠定實驗基礎。
　　方法：
　　1.設計含有甲基化位點的引物，PCR目的基因和載體。將擴增得到的片段進行純化，目的片段與載體PCR產(chǎn)物取相同摩爾數(shù)混合；利用識別甲基化C的 FspEⅠ內(nèi)切酶，向混合均勻的PCR產(chǎn)物中加入T4 DNA連接酶、FspEⅠ內(nèi)切酶、a

3、ctivator、FspEⅠ內(nèi)切酶buffer，以及ATP混勻，快速構建重組質(zhì)粒pTac-Cas9、pMV261-Cas9、pMV261-ClpC2及 pMV261-mCherry。分別將重組質(zhì)粒 pTac-Cas9轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α；pMV261-Cas9、pMV261-ClpC2以及pMV261-mCherry轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌，利用Western-blot檢測其蛋白的表達活性。
　　2.通過在熒光報告基因mCherr

4、y的ORF中插入了guide RNA的靶標序列，并在靶標序列的兩側預留了不同長度的上下游同源編碼區(qū),利用Cas9蛋白切割，被隔開的mCherry基因通過同源重組的方式進行自我修復，用肉眼直接觀察是否出現(xiàn)紅色菌落判斷其修復功能。在此基礎上，設計了與靶標序列互補長度不同的guide RNA以及向guide RNA添加與靶標序列不配對的堿基進行切割實驗，利用抗性平板篩選，最后通過紅色菌落進行計數(shù)，用SPSS軟件進行分析。
　　結果：

5、r>　　1.利用FspEⅠ內(nèi)切酶和T4連接酶一步反應的分子克隆方法，成功構建了在大腸埃希菌DH5α的表達質(zhì)粒pTac-Cas9，測序鑒定正確, Western-blot檢測結果顯示Cas9蛋白在DH5α中表達成功；此外，利用該技術構建了可在分枝桿菌中表達的質(zhì)粒 pMV261-Cas9、pMV261-ClpC2及pMV261-mCherry，并在恥垢分枝桿菌中成功表達ClpC2和mCherry蛋白，但pMV261-Cas9轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌

6、不成功，原因有待進一步研究。
　　2.通過在熒光報告基因mCherry的ORF中插入了guide RNA的靶標序列，并在靶標序列的兩側預留了不同長度的上下游同源編碼區(qū)，通過Cas9蛋白切割實驗發(fā)現(xiàn)，沒有同源區(qū)域的質(zhì)粒被切割后無紅色菌落。而包含42bp、78bp、136bp同源區(qū)的質(zhì)粒被Cas9切割后可以有效重組，經(jīng)過紅色菌落計數(shù)，發(fā)現(xiàn)具有相似的重組效率；與靶標序列互補長度不同的guide RNA，結果顯示配對區(qū)域為19bp具有最高

7、的切割效率，20bp次之，其他長度效率依次降低；向guide RNA添加與靶標序列不配對的堿基進行切割實驗，發(fā)現(xiàn)guide RNA相比靶標序列突變的堿基位置位于倒數(shù)第二位或第六位（5′-3′）仍能被Cas9切割，出現(xiàn)脫靶效應。
　　結論：
　　1.成功建立了一種不受序列限制、酶切連接反應一步進行的分子克隆方法，構建了在大腸埃希菌DH5α中的表達質(zhì)粒pTac-Cas9、分枝桿菌中的表達質(zhì)粒pMV261-Cas9、pMV261-