一個功能未知基因BbAPL對球孢白僵菌氣生菌絲形成的影響.pdf

1、昆蟲病原真菌是自然界中控制昆蟲種群數(shù)量重要的微生物類群。同其它病原微生物相比，昆蟲病原真菌具有主動侵染的特性，在防治刺吸式口器害蟲、鞘翅目害蟲以及昆蟲的卵、蛹等方面具有獨特的優(yōu)勢。但是，目前真菌殺蟲劑遠不如細菌殺蟲劑如Bt(Bacillus thuringiensis)類應用廣泛。造成這一局面的主要原因在于真菌殺蟲劑對環(huán)境因素依賴性強，而且缺乏穩(wěn)定生物學活性的劑型。加強對昆蟲病原真菌致病及逆境適應分子基礎研究將有助于高效真菌殺蟲劑的研制

2、和應用效果的提高。 為了研究昆蟲病原真菌致病性與適應性的分子機理，本論文以國內外應用廣泛的球孢白僵菌為研究材料，通過農桿菌介導的T-DNA隨機插入突變，篩選得到一個表型明顯變化的突變體212。利用YADE法克隆得到一個未知功能基因，該基因推測的氨基酸序列與一個功能未知的假定蛋白具有59％同源性，含有一個酸性磷酸酶結構域，其酵母表達產物具有磷酸酶活性。但該基因與已知的磷酸酶基因沒有同源性，故命名為BbAPL(Acid phosph

3、atase-like in Beauveria bassiana)。利用同源重組技術將BbAPL破壞后，進一步研究了其在球孢白僵菌中的功能。論文的主要內容如下： 1、T-DNA隨機插入突變體的獲得及相關基因的克隆 1.1突變體的獲得與特征分析 從農桿菌介導的T-DNA隨機插入突變庫中得到一個具有明顯表型變化的突變體212，在Czapek基本培養(yǎng)基上形成的菌落較瘠薄，氣生菌絲稀疏，產孢量顯著下降等。Southern

4、雜交結果顯示，T-DNA在突變體212基因組中為單拷貝插入。利用YADE(Y-sllaped adaptor dependent extension)法克隆獲得突變體T-DNA的側翼序列。序列分析結果表明，212的T-DNA插入區(qū)域為一個功能未知基因的ORF區(qū)域。 1.2 突變體212相關基因的克隆與序列分析 根據突變體212的T-DNA魄ging結果設計引物，利用YADE法克隆得到基因的全基因編碼序列，利用YRACE技

5、術克隆得到其cDNA序列。序列分析結果顯示，該基因含有一個58 bp的內含子，ORF長為1431 bp，編碼476個氨基酸，推測分子量為49.8 kDa，等電點為7.14。該基因的(G+C)含量高達61.5％，具有高表達量蛋白的特征。對編碼的氨基酸序列進行功能保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有一個磷酸酶結構域，具有組氨酸酸性磷酸酶家族的典型的保守序列RGH，故命名為BbAPL(Acid phosphatase-like in B.bassi

6、ana)。NCBI數(shù)據庫中沒有任何已知功能基因與BbAPL同源?？寺〉玫紹bAPL上游序列Papl約1.3 kb。Southern雜交結果顯示，BbAPL在球孢白僵菌基因組中以單拷貝形式存在。 2、BbAPL表達、定位與磷酸酶活性測定 2.1 BbAPL的表達與定位分析 將綠色熒光蛋白融合于BbAPL的碳端，融合基因BbAPL：：eGFP置于BbAPL的啟動子Papl控制之下，利用報告基因進行BbAPL的表達定

7、位分析。結果顯示，分生孢子與菌絲內部以及菌絲隔上的熒光較強。由此推測，BbAPL主要分布在分生孢子和菌絲的胞質內以及菌絲的隔上。 RT-PCR結果顯示，BbAPL在氣生菌絲(4 d、8 d)與分生孢子(14 d)中的表達水平沒有顯著差異，這與含融合報告基因BbAPL：：eGFP的轉化子熒光觀察結果相一致。但在氣生菌絲與基內菌絲之間BbAPL的表達有一定的差異。通過冰凍切片觀察發(fā)現(xiàn)，氣生菌絲和分生孢子的熒光要強于基內菌絲，即BbA

8、PL在氣生菌絲和分生孢子內的表達水平高于基內菌絲。 2.2 BbAPL具有磷酸酶活性 將BbAPL在酵母中表達。活性檢測結果表明，酵母表達的BbAPL具有磷酸酶活性，可以水解pNPP底物，但不能作用于bis-(p-nitrophenyl)底物，即具有水解磷酸單酯鍵但不具有水解磷酸二酯鍵的功能。盡管BbAPL與植酸酶具有相似的活性結構域，但并不具有水解植酸的能力。以pNPP為底物測定的磷酸酶BbAPL的最適pH值為6.0。

9、 3、BbAPL的功能研究 為進一步明確BbAPL在球孢白僵菌中的功能，采用同源重組策略破壞BbAPL，構建了以bar基因為抗性篩選標記的同源重組載體，通過農桿菌介導的遺傳轉化導入球孢白僵菌，利用PCR篩選得到4個同源重組突變體RC2、RC53、RC59和RC63。Southern雜交結果顯示這4個同源重組突變體中，bar表達元件被插入到BbAPL的ORF中，而且均是單拷貝插入。 3.1 BbAPL的缺失不影響球

10、孢白僵菌對逆境脅迫的適應性 BbAPL同源重組突變體在高溫和高滲條件下的生長速率以及分生孢子對逆境的抗性與野生菌株沒有顯著差異。 3.2 BbAPL缺失導致菌落生長瘠薄，生物量和產孢量顯著下降 菌落形態(tài)觀察結果表明，在基本培養(yǎng)基(Czapek)上同源重組突變體的氣生菌絲比野生菌株瘠薄。同源重組突變體的積累的生物量只有野生菌株和異位轉化子的1/3左右。在固體Czapek培養(yǎng)基上，不同菌株之間的產孢量也有很大差異，同

11、源重組突變體的產孢量顯著低于野生菌株，不到野生菌株和異位轉化子產孢量的50％。推測BbAPL的缺失造成產孢量的下降可能與菌落氣生菌絲較瘠薄有關。 3.3 BbAPL的缺失影響氣生菌絲的形成和發(fā)育及分生孢子和氣生菌絲的疏水性和附著性 對菌落顯微觀察，結果顯示，同源重組突變體的氣生菌絲較野生菌株和異位轉化子稀疏。進一步研究發(fā)現(xiàn)，同源重組突變體菌絲對培養(yǎng)基的穿透和氣生菌絲的形成都比野生菌株和異位轉化子滯后。表明BbAPL的缺失

12、影響了球孢白僵菌氣生菌絲的形成與發(fā)育。這也可能是出現(xiàn)菌落瘠薄的表型的原因之一。 絲狀真菌氣生菌絲的形成過程與其疏水性有密切關系。對不同菌株氣生菌絲疏水性檢測結果表明，同源重組突變體的氣生菌絲的疏水性顯著下降。用(親水/疏水)兩相分布法檢測各菌株分生孢子的疏水性。測定結果顯示，同源重組突變體的分生孢子的疏水性比野生菌株下降約16-20％。分生孢子與菌絲對疏水表面的附著性也出現(xiàn)一定程度的降低，分別下降了約8％和13％。 3.

13、4 BbAPL缺失促進氣生菌絲之間的融合 在基本培養(yǎng)基Czapek上生長，同源重組突變體的氣生菌絲之間形成大量短的菌絲橋并相互融合。推測該現(xiàn)象可能與氣生菌絲疏水性下降有關。 3.5 BbAPL影響菌株對無機磷敏感性 與野生菌株相比，在含有高濃度無機磷(K2HPO4)的培養(yǎng)基上同源重組突變體氣生菌絲生長受到顯著抑制，但在低濃度無機磷條件下，其氣生菌絲生長與野生菌株沒有明顯差異。推測BbAPL可能與無機磷的吸收利用有