球孢白僵菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化研究及其殺蟲相關(guān)基因的分離.pdf

1、遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)不僅是基礎(chǔ)研究的重要手段，而且是利用基因工程改良物種特性的有力工具。目前有關(guān)球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究較少。本文針對分離自吉林公主嶺當(dāng)?shù)鼗疾∮衩酌x體的野生型球孢白僵菌為研究對象，從產(chǎn)孢培養(yǎng)基篩選、遺傳轉(zhuǎn)化顯性標(biāo)記篩選、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化等方面對球孢白僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行探索，為利用基因工程改良球孢白僵菌奠定了堅實基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明：(1)菌絲生產(chǎn)最適培養(yǎng)基為L-broth液體培養(yǎng)基；(2)產(chǎn)孢最適培養(yǎng)基為P

2、DA培養(yǎng)基；(3)菌齡24h的菌絲體生產(chǎn)的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，是2.25×1010個/g；(4)用0.01mol/L的β-巰基乙醇在30℃預(yù)處理菌絲體20m，原生質(zhì)體純度達(dá)到99﹪以上，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生恢復(fù)率較高；(5)真菌溶壁酶的最適消化濃度是6.0mg/ml，作用時間是1.5小時；(6)0.7mol/LNaCl為原生質(zhì)體制備的最佳滲透壓穩(wěn)定劑；(7)0.7mol/L葡萄糖為原生質(zhì)體再生恢復(fù)的最佳滲透壓穩(wěn)定劑；(8)L-broth軟瓊

3、脂培養(yǎng)基(0.75﹪的瓊脂粉)上再生恢復(fù)率最高，最高可達(dá)到57﹪；(9)球孢白僵菌原生質(zhì)體萌發(fā)可以被25mg/L除草劑完全抑制，孢子和菌絲體萌發(fā)可以被150mg/L除草劑完全抑制，草丁膦類除草劑(phosphinothricin，PPT)可以作為球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化時的選擇壓，除草劑抗性基因bar可以作為選擇標(biāo)記基因；(10)通過原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化方法，將含有bar基因的質(zhì)粒PTF102轉(zhuǎn)化到球孢白僵菌，通過連續(xù)5代繼代篩選，獲得PCR鑒定

4、陽性菌落。 穿透體壁是球孢白僵菌感染寄主過程中的重要步驟之一。昆蟲體壁主要由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)組成，球孢白僵菌主要通過機(jī)械壓力和蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等水解酶的作用降解昆蟲體壁，因此，克隆編碼這些酶的基因?qū)﹃U明球孢白僵菌的致病分子機(jī)理具有重要意義。本文根據(jù)已報道的病原真菌幾丁質(zhì)酶、體壁蛋白水解酶、親環(huán)素蛋白基因合成保守引物，從玉米螟蟲生真菌球孢白僵菌中分別分離到幾丁質(zhì)酶基因、體壁蛋白水解酶和親環(huán)素蛋白基因，生物信息學(xué)分析顯示：(1)幾丁質(zhì)

5、酶基因片段大小為1047bp，編碼了348個氨基酸，與來源于小菜蛾蟲生真菌球孢白僵菌和哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶蛋白序列同源性分別為99﹪和82﹪；(2)體壁蛋白水解酶基因片段長度為1760bp，包含有3個內(nèi)含子區(qū)段，分別位于331～405，586～646，1157～1223bp的位置，該基因編碼了一個由377個氨基酸組成的蛋白，與蛋白數(shù)據(jù)庫中同源蛋白(AAL5578.1，AAK70804.1)的最高同源性分別為98.9﹪和98.7﹪；(3)親