原生質(zhì)體

1、原生質(zhì)體（原生質(zhì)體（ProtoplastProtoplast）:指采用機械或酶解法去掉細胞壁的裸露細胞指采用機械或酶解法去掉細胞壁的裸露細胞。一、原生質(zhì)體的應(yīng)用一、原生質(zhì)體的應(yīng)用由于沒有細胞壁，原生質(zhì)體為作物遺傳改良和植物學(xué)研究提供了極為有利的試驗材料。原生質(zhì)體可以用于下面幾種研究。用作細胞雜交服務(wù)于作物改良用作遺傳轉(zhuǎn)化的對象研究細胞壁的發(fā)生過程篩選突變體膜的結(jié)構(gòu)、運輸、激素接受位點等的研究用于分離細胞器和大分子種質(zhì)資源保存二、原生質(zhì)體

2、分離、純化二、原生質(zhì)體分離、純化原生質(zhì)體分離的最基本原則是保證原生質(zhì)體不受傷害及不損害它的再生能力。（一）分離方法（一）分離方法機械法分離缺點：產(chǎn)量極低；應(yīng)用的材料受限制；操作極費力酶法分離Cocking最早開展這方面研究克服了機械法分離的缺陷，可分為直接法和順序法兩種。酶法可在短時間內(nèi)獲得大量原生質(zhì)體，缺點是：不純的酶制劑所含雜質(zhì)對原生質(zhì)體可能有不同程度的毒害作用。（二）影響原生質(zhì)體分離的因素（酶法）（二）影響原生質(zhì)體分離的因素（酶法

3、）從理論上講，只要用適當?shù)拿柑幚?，就能從任何活組織中分離得到原生質(zhì)體。但是對于原生質(zhì)體培養(yǎng)來說，要得到活性高、能進行分裂、形成愈傷組織、最后再生完整植株的原生質(zhì)體則受許多因素的影響。原生質(zhì)體分離時主要應(yīng)考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時間、溫度等。1.外植體來源:生長旺盛、生命力強的組織和細胞是獲得高活力原生質(zhì)體的關(guān)鍵，并影響著原生質(zhì)體的復(fù)壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。用于原生質(zhì)體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根

4、、子葉、莖段、胚、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物（Suspensioncultures）、原球莖、花瓣和葉表皮等。葉肉細胞是常用的材料因為葉片很易獲得而且能充分供應(yīng)。取材時，一般用剛展開的幼嫩葉片。另一個分離原生質(zhì)體的常用材料是愈傷組織或懸浮細胞，采用其作材料可以避免植株生長環(huán)境的不良影響，可以常年供應(yīng)，易于控制新生細胞的年齡，處理時操作方便，無需消毒.選用懸浮細胞作材料時，需每隔35天繼代一次，培養(yǎng)一段時間使細胞處于旺盛生長狀態(tài)。一般在繼代后的

5、第三天游離原生質(zhì)體。2.酶液組成和濃度：纖維素占壁干重的2550%植物細胞壁由三個主要成分構(gòu)成半纖維素平均53%果膠質(zhì)5%1.收集:原生質(zhì)體混合液用濾網(wǎng)(40100m)去掉沒有降解的細胞及組織收集濾液.2.洗滌:將網(wǎng)下物低速離心去掉上清液再加無酶液的CPW液懸起原生質(zhì)體再離心棄上清重復(fù)幾次即可.3.純化:采用上浮法和下沉法兩種純化方法。上浮法是將酶解的原生質(zhì)體與蔗糖溶液（23%左右）混合，下沉法是先將原生質(zhì)體與13%的甘露醇混合，然后加

6、到23%的蔗糖溶液頂部，形成一個界面。兩種方法中，均在100g下離心510分鐘，會在蔗糖溶液頂部形成一條原生質(zhì)體帶。用吸管將帶輕輕地吸出來，用培養(yǎng)基懸浮離心，然后稀釋到104105ml，用于培養(yǎng)。4.活力測定:原生質(zhì)體培養(yǎng)前通常要進行活力檢查，以便知道其狀態(tài)是否正常。測定原生質(zhì)體活力的方法主要有觀察胞質(zhì)環(huán)流（Cytoplasmicstreaming）、測定呼吸強度和FDA染色，其中最常用的是FDA法。FDA是熒光素雙醋酸酯（Fluesc

7、eindiacetateFDA），常用丙酮配置成2mgml溶液，在冰箱（4C）中保存。FDA本身沒有極性，無熒光，可以穿過細胞膜自由出入細胞，在細胞中不能積累。在活細胞中，F(xiàn)DA經(jīng)酯酶分解為熒光素，后者為具有熒光的極性物質(zhì)，不能自由出入細胞膜，從而在細胞中積累。在紫外光照射下，發(fā)出綠色熒光。相反如果是死細胞，則不會發(fā)出綠色熒光。三、原生質(zhì)體培養(yǎng)三、原生質(zhì)體培養(yǎng)1.原生質(zhì)體計數(shù)原生質(zhì)體培養(yǎng)前必須調(diào)到一定密度即確定每毫升培養(yǎng)基中含多少原生質(zhì)

8、體.用CPW13M懸浮原生質(zhì)體血球計數(shù)板計數(shù)計算稀釋倍數(shù)離心去除CPW13M用所算體積的培養(yǎng)基懸起原生質(zhì)體用于培養(yǎng).2.原生質(zhì)體培養(yǎng)主要有三種方法:(1)液體淺層培養(yǎng)（Liquidthinlayerculture）原生質(zhì)體純化后，將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中取少許于培養(yǎng)皿底部形成很薄的一層，封口進行培養(yǎng)。(2)固體培養(yǎng)（Solidculture）也叫瓊脂糖平板法（Agaroseplateculture）或包埋培養(yǎng)法（Embeddingc

9、ulture）。將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基后，與凝固劑（主要是瓊脂或低熔點瓊脂糖，LMTagarose）按一定比例混合，在培養(yǎng)皿底部形成一薄層，凝固后封口培養(yǎng)。(3)固液雙層培養(yǎng)法（Solidoverliquidculture）此法結(jié)合液體淺層培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的優(yōu)點，在培養(yǎng)皿底部先鋪一層固體培養(yǎng)基，待凝固后再在其上進行液體淺層培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分可以被液體層中的原生質(zhì)體吸收利用，而原生質(zhì)體產(chǎn)生的有毒物質(zhì)可以被固體培養(yǎng)基吸收。植板率