球孢白僵菌孢壁蛋白相關(guān)的耐熱分子機理及其耐熱性狀的遺傳改良.pdf

1、絲孢類殺蟲真菌是害蟲微生物防治的重要資源，球孢白僵菌為其典型代表。本研究從建立生防真菌孢子耐熱性的定量評價技術(shù)體系入手，通過分析揭示孢壁類疏水蛋白含量與孢子耐熱力之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了與孢子耐熱性密切相關(guān)的幾種孢壁蛋白，由此提出了“孢壁結(jié)構(gòu)蛋白參與孢子耐熱性狀”的生物學(xué)假設(shè)。在此基礎(chǔ)上，對一種同孢子耐熱性狀相關(guān)密切的全新孢壁蛋白進行了基因克隆，獲得了該基因的全序并證明它是一個全新基因。通過建立基于球孢白僵菌芽生孢子的新型遺傳轉(zhuǎn)化體系和應(yīng)用反

2、義RNA技術(shù)，證明新基因的缺失使孢子耐熱力顯著降低。利用上述轉(zhuǎn)化體系和模式微生物的抗逆功能基因?qū)η蜴甙捉┚M行遺傳改良，獲得耐熱性狀明顯提高的重組菌株。這些研究催生了有助于球孢白僵菌功能基因分析和菌株遺傳改良的技術(shù)平臺，主要內(nèi)容和結(jié)果分述如下： 孢子耐熱生物學(xué)和FAE蛋白 研究建立了以48℃為脅迫溫度的分生孢子耐熱力的測定方法和定量評價體系。該體系引入一個全新的變量——殘存指數(shù)I<,s>，是指孢子在48℃脅迫下不同時刻的

3、殘存活孢率與未經(jīng)脅迫的孢子萌發(fā)率的比值。球孢白僵菌和玫煙色擬青霉共11個菌株的殘存指數(shù)隨脅迫時間的衰變過程均很好地擬合邏輯斯蒂模型(r<'2>≥0.97，P<0.01)。根據(jù)所擬合各菌株的模型，6株球孢白僵菌孢子的致死中時LT<,so>平均為40.7(10.1～61.9)min，而5株玫煙色擬青霉的LT<,50>平均為4.6(2.8～6.2)min。培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件均可影響生防真菌孢子的耐熱力。以蛋白胨作為氮源時，2～4％葡萄糖為最

4、優(yōu)，2％蔗糖次之，淀粉最差；以硝酸銨代替蛋白胨作為氮源時，4％葡萄糖為最優(yōu)，1％淀粉次之，蔗糖最差。以薩氏培養(yǎng)基SDAY作為基本培養(yǎng)基時，25℃和pH 5～6的條件適合生產(chǎn)更耐熱的孢子，這與白僵菌最適的生長條件基本一致?；A(chǔ)培養(yǎng)基中終濃度為≤50μg/mL的Mn2+作為離子添加劑，有助于提高孢子的耐熱力，但添加Fe3+和Cu2+則顯著降低孢子的耐熱力，而不超過150μg/mL的Zn<'2+>對孢子耐熱力的影響不顯著。孢子耐熱力隨孢內(nèi)離子

5、含量增高而下降。 分生孢子孢壁類疏水蛋白即可甲酸抽提的(FAE)蛋白含量在所測定的不同菌種和菌株間差異顯著。培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件可影響生防真菌孢子FAE蛋白的累積。以蛋白胨作為氮源時，孢壁FAE蛋白含量隨著葡萄糖或蔗糖濃度從0.5％增至2％而達最高，而隨淀粉濃度增至2％下降，并隨淀粉濃度進一步增高而呈現(xiàn)波動；以硝酸銨代替蛋白胨作為氮源時，F(xiàn)AE蛋白含量隨著葡萄糖或蔗糖濃度從0.5％增至2％而達最高，隨著淀粉濃度增高至1％而達最高

6、。金屬離子濃度低于50μg/mL，F(xiàn)AE蛋白含量均有不同程度下降，在50～200μg/mL范圍內(nèi)則保持相對穩(wěn)定或略增，但高于200μg/mL則顯著升高。 SDS-PAGE分析顯示，同一菌種內(nèi)FAE蛋白組分無明顯變化。球孢白僵菌孢子FAE蛋白中的15.0和17.5 kDa蛋白屬組成型表達，而12.0 kDa蛋白受培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件影響較大。以蛋白胨作為唯一氮源時，F(xiàn)AE蛋白中的12.0 kDa條帶僅出現(xiàn)在低濃度葡萄糖或蔗糖的條件

7、下，但不受淀粉的影響。以硝酸銨代替蛋白胨后，12.0 kDa蛋白的表達則不受碳源種類及其濃度的影響。12.0 kDa蛋白的表達受Mn2+、Cu2+和Zn2+抑制，而不受Fe3+影響。培養(yǎng)基中的pH、水活度及培養(yǎng)溫度對FAE蛋白組分表達無明顯影響。 相關(guān)性分析顯示，各菌株在48℃熱脅迫下的耐熱力指數(shù)LT<,50<(y)與孢壁FAE蛋白含量呈顯著指數(shù)相關(guān)。源于不同氮源和碳源的孢子在48℃下脅迫45 min后的殘存指數(shù)I<,s>也與相

8、應(yīng)孢子的FAE蛋白含量具有顯著的指數(shù)相關(guān)性。在不同溫度、pH、水活度和金屬離子等條件下培養(yǎng)，所獲孢子的耐熱力與孢子FAE蛋白含量之間不存在顯著相關(guān)性。 綜合分析表明，孢子FAE蛋白可能參與孢子耐熱性狀，其中15.0或17.5 kDa蛋白參與的可能性更大。這種相關(guān)性主要受培養(yǎng)基碳氮源影響，而其它因素不僅影響孢子FAE蛋白，還可能影響孢子耐熱生理機制的其它方面。 耐熱相關(guān)類疏水蛋白的基因克隆與分析選擇最有可能參與孢子耐熱性狀

9、的15.0kDa蛋白(記為BCwl5)作為研究對象，開展蛋白純化、N-端測序、基因克隆和結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCWl5蛋白可選擇性地溶解于30％乙腈溶液中而得到較好的分離。所分離的BCW15蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至PvDF膜，測得其N端11個氨基酸的序列為sFPGGOFIIRN。根據(jù)N端氨基酸序列設(shè)計簡并引物，采用3'-RACE技術(shù)和YADE技術(shù)獲得了該基因的編碼序列和部分啟動子序列，命名為BCW15。經(jīng)聯(lián)網(wǎng)檢索分析證明，BC

10、W15是第一個具有完整編碼信息的球孢白僵菌孢壁蛋白基因，含有長393 bp的開放閱讀框，編碼131個氨基酸，無信號肽序列。采用3'-RACE方法得到兩條長約500 bp和600 bp的擴增產(chǎn)物。它們的編碼區(qū)和絕大部分非編碼區(qū)序列是一致的，末端少部分序列卻存在差異。本研究未能克隆到BCW15基因的啟動子序列，卻發(fā)現(xiàn)其上游序列是富含AT的區(qū)域?；駼CW15基因組序列不含內(nèi)含子，在球孢白僵菌基因組中存在著雙拷貝。 對六株不同地理和寄

11、主來源球孢白僵菌的BCW15氨基酸序列的分析證明，BCWl5含有高度保守的序列HNDRVVGAWDQDVKIV，而且存在多樣性，可分為BCW15a和BCWl5b兩類。這意味著BCW15基因有可能作為球孢白僵菌系統(tǒng)進化研究的新的分子標(biāo)記。 構(gòu)建基于芽生孢子的遺傳轉(zhuǎn)化體系 為了證明上述新基因的功能，首先研究建立了以球孢白僵菌芽生孢子為載體的全新絲孢類真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系。以察氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，終濃度200μg/mL的草丁膦作

12、為轉(zhuǎn)化子篩選的選擇壓，構(gòu)建了含有草丁膦抗性基因bar和綠色熒光蛋白基因egfp的雙元質(zhì)粒pABeG驗證轉(zhuǎn)化體系。球孢白僵菌在限氮液體培條件下產(chǎn)生的芽生孢子經(jīng)0.1 mol/l LiAc處理后成為感受態(tài)細胞。質(zhì)粒pABeG在PEG介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入芽生孢子。芽生孢子的轉(zhuǎn)化效率為24±4.58轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒DNA(n=3)。所有隨機選取的轉(zhuǎn)化子在離體生長和侵染寄主過程中均能穩(wěn)定地表達綠色熒光蛋白基因。繼之，成功構(gòu)建了bar基因的Poly A陷阱質(zhì)

13、粒pUCBAR-TF和pUCBAR-TR，結(jié)合REMI技術(shù)，使陷阱質(zhì)粒pUCBAR-TF經(jīng)芽生孢子轉(zhuǎn)化單位點插入到球孢白僵菌的基因組DNA中。這一技術(shù)有利于分離和鑒定表型相關(guān)基因，也是PolyA陷阱技術(shù)在殺蟲真菌中標(biāo)記基因的首次應(yīng)用。 BCW15蛋白生物學(xué)功能驗證 采用反義RNA技術(shù)抑制基因的表達驗證BCW15基因的生物學(xué)功能。構(gòu)建含有BCW15基因反義RNA轉(zhuǎn)錄元件和篩選標(biāo)記bar基因的反義質(zhì)粒pA-N52-antiB

14、CW15-Bar。利用REMI技術(shù)和芽生孢子轉(zhuǎn)化體系，將反義質(zhì)粒插入球孢白僵菌基因組DNA中。隨機選取5個插入反義質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)至產(chǎn)孢，所獲轉(zhuǎn)化子分生孢子的FAE蛋白的含量均顯著低于野生菌株及轉(zhuǎn)化對照菌株之間差異極顯著。對FAE蛋白組分進行分析表明，BCW15蛋白在反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的孢子中未見表達，而其它兩個主要組分的表達未見顯著變化。這說明反義RNA技術(shù)是球孢白僵菌基因功能驗證的有效工具，芽生孢子轉(zhuǎn)化體系是有效的轉(zhuǎn)化載體。 金

15、屬硫蛋白的異源表達及其生物學(xué)功能 將粗糙脈孢霉金屬硫蛋白基因?qū)肭蜴甙捉┚?，以評價該蛋白是否具有保護孢子免受熱脅迫損傷的功能。先構(gòu)建含有金屬硫蛋白基因MT和篩選標(biāo)記bar基因的雙元質(zhì)粒pAN52-MT-Bar，再將此雙元質(zhì)粒經(jīng)芽生孢子轉(zhuǎn)化體系介導(dǎo)轉(zhuǎn)入球孢白僵菌基因組DNA中。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子菌絲的巰基含量均顯著高于野生菌株和對照質(zhì)粒pAN52．Bar轉(zhuǎn)化的菌株。選取3個巰基含量高的轉(zhuǎn)化子，Western雜交顯示MT蛋白在轉(zhuǎn)化子中

16、被高效表達。 三個轉(zhuǎn)化子的分生孢子在48℃下脅迫30 min后的平均殘存指數(shù)為0.74(0.71-0.76)，顯著高于野生菌株CK的0.66和對照轉(zhuǎn)化菌株TCK的0.68(F<,4,10>=8.4，P<0.05)。將脅迫時間延長，菌株CK、TCK和轉(zhuǎn)化子M4(脅迫30 min后的殘存指數(shù)在3個轉(zhuǎn)化子中居中)的殘存指數(shù)隨時間的衰變過程均很好地擬合邏輯斯蒂方程(r<'2>≥0.98，P<0.01)，同此估計獲得菌株CK、TCK和M4

17、的LT<,50>分別為41.1、40.4和45.8 min。這表明重組金屬硫蛋白的球孢白僵菌分生孢子的LT<,50>延長了約5.0 min，即耐熱力顯著增強。 綜上所述，本研究的主要結(jié)果，一是建立了殺蟲真菌分生孢子耐熱性測定的技術(shù)方法和定量評價體系，改進了孢子中可甲酸抽提(FAE)蛋白的提取方法，探明了影響孢子耐熱力和FAE蛋白積累的因素。二是發(fā)現(xiàn)了參與孢子耐熱性狀的幾種孢壁FAE蛋白，并據(jù)此提出了新的生物學(xué)假說。三是首次克隆了