球孢白僵菌對苯并咪唑類殺菌劑抗性的分子機(jī)理及遺傳改良.pdf

1、絲孢類殺蟲真菌是害蟲微生物防治的重要資源,球孢白僵菌(Beauveria bassiana)為典型代表。用于作物害蟲防治的生防真菌制劑一般都是以分生孢子為有效侵染體的活體制劑,在作物環(huán)境中會遇到防治作物病害而噴灑的化學(xué)殺菌劑而失活,尤其上世紀(jì)六十年代以來被廣泛用于防治各種真菌性植物病害的苯并咪唑類殺菌劑。因此,賦于生防真菌抗殺菌劑的特性是提高生防真菌制劑田間適應(yīng)性和害蟲防治效果的重要途徑。本研究從20株野生球孢白僵菌分生孢子對多菌靈等苯

2、并咪唑類殺菌劑的抗性評價入手,開展了Bb2860菌株的化學(xué)誘變及其若干隨機(jī)突變子β-微管蛋白編碼基因TUB1的序列分析,比較了隨機(jī)突變子的有絲分裂異常與抗逆性狀的關(guān)聯(lián),進(jìn)行了TUB1的定點(diǎn)突變分析,分離出抗藥性和耐熱力的主要關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。主要內(nèi)容分述如下： β-微管蛋突變導(dǎo)致的球孢白僵菌苯并咪唑類殺菌劑抗性及耐熱力變化用含不同濃度多菌靈(C)的薩氏培養(yǎng)基(SDAY)平板評價20株野生球孢白僵菌對多菌靈的抗性。將各菌株分生孢子在不同濃

3、度多菌靈的平板上培養(yǎng)4天后的菌落形成數(shù)和無藥SDAY平板上菌落形成數(shù)的比值,定義為分生孢子殘存指數(shù)Is。各菌株Is觀察值分別擬合邏輯斯蒂方程Is=1/[1+exp(α+βC](r2≥0.93)。求解擬合的方程得出對各菌株的半致死濃度EC50和最小抑制濃度MIC(即抑菌99％的濃度EC99)。結(jié)果顯示,20株野生菌除一株為低抗型外,其余對多菌靈均表現(xiàn)敏感。根據(jù)各野生株的綜合性狀,選定Bb2860菌株進(jìn)行亞硝酸鈉處理的化學(xué)誘變,獲得13個隨

4、機(jī)突變子,其中2個高抗突變子能擬合上述邏輯斯蒂方程(r2≥0.93),而其余11個超高抗突變子只能擬合密度方程Is=(α-βC)-I/λ(r2≥0.92)。所有11個超高抗突變子對多菌靈的MIC＞1000μg/mL,在Bb2860野生株的MIC(=1.32μg/mL)提高758倍以上。經(jīng)三次傳代培養(yǎng),所有隨機(jī)突變子的抗性均穩(wěn)定遺傳,并且萌發(fā)率和產(chǎn)孢能力未受明顯影響。 所有13個突變子的分生孢子在48℃下隨熱脅迫時間(t)衰變的殘

5、存指數(shù)Is也擬合邏輯斯蒂方Is=1/[1+exp(α+βt)](r2≥0.97)。結(jié)果顯示,突變子的半致死時間LT50介于1.8～9.6 min之間,遠(yuǎn)低于野生株的36 min。對突變子的孢壁類疏水蛋白含量即可甲酸抽提的(FAE)孢壁蛋白含量進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn),誘變引起的孢子耐熱力下降與FAE含量并無關(guān)聯(lián),而其中EC50＜1000 μg/ml的6個突變子加野生菌株的抗藥性(0.73～919.6μg/mL)與耐熱力之間符合冪函數(shù)關(guān)系LT50=

6、34.44·(EC50)-0.221(r2=0.96)。 TUB1是β-微管蛋白的編碼基因,具有高保守性。對13個隨機(jī)突變子與野生菌株的TUB1進(jìn)行序列比對后,發(fā)現(xiàn)抗藥性相關(guān)的突變位點(diǎn)Q134、F167和E198也是植物病原真菌中常見的抗藥性突變位點(diǎn)。尤其E198位點(diǎn)發(fā)生突變的Bb2860突變子的EC50均超過1000μg/ml,而Q134位點(diǎn)的突變發(fā)生于12個突變子中,此位點(diǎn)突變在植物病原真菌中可導(dǎo)致熱敏感。由于化學(xué)誘變的隨機(jī)

7、性,除上述常見突變位點(diǎn)之外,還發(fā)現(xiàn)另外37個位點(diǎn)的突變也出現(xiàn)在各突變子序列中,每個突變子TUB1發(fā)生突變的位點(diǎn)有1～8個不等。結(jié)果表明,球孢白僵菌與植物病原真菌一樣,其β-微管蛋白與苯并咪唑類殺菌劑抗性有密切的關(guān)系,特別是E198位點(diǎn)的突變；Q134位點(diǎn)的突變可能與孢子的耐熱力下降有關(guān),TUB1其他位點(diǎn)的突變也可能影響球孢白僵菌生理的其他方面。球孢白僵菌β-微管蛋白突變與有絲分裂選擇抗藥性最強(qiáng)、耐熱力最差的突變子Bb2860m2-2為對

8、象,通過有絲分裂的恢復(fù)試驗和對微管蛋白的熒光免疫染色試驗,觀察多菌靈和溫度對其分生孢子萌發(fā)和芽管中有絲分裂的協(xié)同影響。用孢子萌發(fā)芽管中分裂成雙核或多核的孢子數(shù)占孢子總數(shù)的比值,作為染色體有絲分裂指數(shù)CMI。結(jié)果發(fā)現(xiàn),30℃下在SDAY平板上生長4天的突變子菌落直徑僅為1.1 mm左右,而加入1μg/ml的多菌靈則使菌落直徑恢復(fù)到3.76 mm,接近于Bb2860野生株在無藥SDAY平板上的4.3 mm(25℃)和3.86 mm(30℃)

9、。在不同溫度熱脅迫試驗中,同樣發(fā)現(xiàn)低濃度多菌靈能降低突變子的熱敏感度,特別是在32℃和35℃對其生長的恢復(fù)作用明顯,40℃以上的恢復(fù)作用則不明顯。 通過熒光免疫染色發(fā)現(xiàn),野生株在存在多菌靈的情況下,微管數(shù)量減少,α-及β-微管蛋白的形成也減少,在32℃無藥處理中也有此趨勢,溫度升高與多菌靈的作用類似,均有使微管解聚的現(xiàn)象。在突變株中,在25℃下就出現(xiàn)與野生株不同的情形,芽管中微管蛋白濃度并不連續(xù),大量聚集在芽管頂端,其他部位的分

10、布很不均勻；在32℃下,β-微管蛋白除了聚集在芽管頂端之外,其他部分很少存在,但是α-微管蛋白卻彌散于整個芽管和孢子中。另外,在32℃下加入1μg/ml多菌靈,β-微管蛋白的不均勻聚集程度則有所緩和。 綜合微管免疫染色和CMI的觀察結(jié)果,微管蛋白基因的突變造成β-微管蛋白對α-微管蛋白競爭結(jié)合能力的增強(qiáng),同時卻導(dǎo)致微管的結(jié)構(gòu)異常。微管的不均勻分布在32℃對微管失去聚合動態(tài)平衡的溫度下,導(dǎo)致游離β-微管蛋白單體出現(xiàn),而加入多菌靈則

11、可以中和游離的β-微管蛋白,使生長得到恢復(fù)。這種過穩(wěn)定結(jié)構(gòu)溫度越高越強(qiáng),故使多菌靈在更高溫度下對突變子的有絲分裂恢復(fù)作用不明顯。在高溫和多菌靈共同解聚作用下,野生菌株的微管蛋白量非常低,而突變子則仍然很高,這顯示野生株為避免游離β-微管蛋白單體的毒害而存在蛋白翻譯的自我調(diào)節(jié)機(jī)制,突變子則無此功能。β-微管蛋白定點(diǎn)突變對熱敏感和抗藥性的分離為了明確球孢白僵菌TUB1上位點(diǎn)突變的功能而獲得具有多菌靈抗性但無熱敏感的工程菌株,選擇了2個在隨機(jī)

12、誘變中表現(xiàn)耐熱力和抗藥性相關(guān)的Q134和E198位點(diǎn)分別進(jìn)行4種氨基酸的點(diǎn)突變。應(yīng)用基因重疊延伸技術(shù)(SOE)簡化基因序列定點(diǎn)突變的改造程序。在進(jìn)行目的位點(diǎn)的突變之前,把TUB1內(nèi)部可能發(fā)生沖突的酶切位點(diǎn)進(jìn)行突變,根據(jù)球孢白僵菌密碼子偏愛和保持突變后氨基酸序列一致的情況下調(diào)整TUB1。在定點(diǎn)突變后,利用球孢白僵菌芽生孢子轉(zhuǎn)化體系將經(jīng)過定點(diǎn)突變的TUB1轉(zhuǎn)入表達(dá)載體,再轉(zhuǎn)入白僵菌進(jìn)行表達(dá)和分析。在定點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)化子中,Q134K、Q134E

13、、Q134G和Q134C的耐熱力明顯下降,在48℃熱激下的LT50均在5 min之內(nèi)：多菌靈抗性的增強(qiáng)十分有限,提高最多的Q134G轉(zhuǎn)化子的EC50僅為野生菌株的2倍。E198D、E198G、E198K和E198C的耐熱力則顯著高于Q134的定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)化子,在48℃熱激下E198C的LT50為34.3 min,十分接近野生株的36.0 min及pAN52-Bar轉(zhuǎn)化子對照的36.3 min,E198G和E198K的LT50也在30 mi

14、n左右,耐熱力最差的E198D也達(dá)23.3 min。E198D對多菌靈的抗性同樣優(yōu)于Q134的定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)化子,除E198C抗性增強(qiáng)略低之外,其余突變子均增強(qiáng)10倍左右。 根據(jù)定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)化子的抗逆表現(xiàn),Q134位點(diǎn)的突變明顯與耐熱力下降有關(guān),而E198位點(diǎn)的突變則顯著提高對多菌靈的抗性。但在多菌靈抗性方面,定點(diǎn)突變未能像隨機(jī)誘變那樣大幅度提高抗藥性,這可能與孢子本身TUB1的存在有關(guān)。嘗試對E198進(jìn)行其他氨基酸的突變或者對TUB

15、1進(jìn)行沉默,有可能獲得更高的抗性。 綜上所述,本研究的主要創(chuàng)新,一是建立了球孢白僵菌分生孢子對多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑抗性測定的定量評價技術(shù)體系,通過比對TUB1基因的序列發(fā)現(xiàn)了多菌靈抗性和β-微管蛋白的相關(guān)性。二是通過TUB1基因的定點(diǎn)突變和轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)了顯著分別影響耐熱力和多菌靈抗性的位點(diǎn)Q134和E198,獲得了抗藥性增強(qiáng)10倍、耐熱力不受影響的工程菌株。三是引入CMI概念對微管進(jìn)行熒光免疫染色,從細(xì)胞生物學(xué)角度揭示了突變子