Sphingomonas sanxanigenens TP-3 ugdG基因的克隆、表達及工程菌的構(gòu)建.pdf

1、鞘氨醇膠是由鞘氨醇單胞菌屬分泌的一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的胞外多糖(EPS)。主要包括Sphingomonas elodea ATCC31461產(chǎn)生的結(jié)冷膠，Sphingomonas sp.ATCC31555產(chǎn)生的韋蘭膠，Sphingomonas sp.ATCC31961產(chǎn)生的鼠李膠以及Sphingomonas sp.ATCC31559產(chǎn)生的迪特膠。生物聚合物Ss是一類由S.sanxanigenens TP-3產(chǎn)生的一種新型鞘氨醇膠，與其他的鞘氨醇

2、膠需要用預(yù)冷的2倍體積異丙醇提取相比，Ss膠的提取只需要將發(fā)酵液pH調(diào)至3.0左右，這一特性極大程度上降低了其生產(chǎn)成本。
　　 本研究利用兼并PCR和Tail PCR擴增得到了S.sanxanigenens TP-3中的ugdG基因(NCBI序列號為JQ923477)。ugdG的編碼產(chǎn)物為UDP-葡萄糖脫氫酶，分子量48.2 KDa，能夠?qū)s膠合成活性前體UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為另一個活性前體UDP-葡萄糖醛酸。UgdG蛋白與Sp

3、hingomons sp.KC8中的Ugd蛋白具有最高的相似性，相似性為77％。構(gòu)建了E.coli的表達菌體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后純化融合蛋白His6-UgdG，測定酶活性發(fā)現(xiàn):酶活力為1325 U/g左右，相對于UDP-葡萄糖和NAD+的Km值分別為0.47mM和0.38mM。在UgdG蛋白的C端具有不同于其他同源蛋白的假定α螺旋(氨基酸殘基為:N-KMAEDAATG-C)，分析發(fā)現(xiàn)此α螺旋對蛋白酶活性和三維結(jié)構(gòu)的影響不大，可能只是起到維

4、持蛋白三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用。構(gòu)建了含多拷貝ugdG基因的重組菌株，發(fā)酵分析發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液粘度增加、Ss膠產(chǎn)量提高了15.3％左右。對重組菌株產(chǎn)生的Ss膠進一步分析發(fā)現(xiàn)，UgdG蛋白酶活性的提高增加了Ss膠的聚合度，而其單糖組成并沒有發(fā)生變化。因此可以說明，UgdG蛋白是Ss膠的生物合成中的關(guān)鍵酶。然而，TP-3在發(fā)酵過程中不能以淀粉為碳源。為了降低生產(chǎn)成本，本實驗中構(gòu)建了一株能利用一定量淀粉的重組菌S.sanxanigenens(pMMamy