吡咯喹啉醌工程菌構(gòu)建及關(guān)鍵基因研究.pdf

1、吡咯喹啉醌(PQQ)，是一種新型輔酶，利用微生物產(chǎn)PQQ是目前研究的熱點也是難點，本論文以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌(E.coli BL21)為宿主菌，采用誘變和分子生物學(xué)的方法，從以下幾個方面篩選和構(gòu)建了PQQ的高產(chǎn)菌，并確定了PQQ的高效液相色譜(HPLC)法檢測PQQ的條件。
　　 1、本論文以K.pneumoniae為出發(fā)菌株，采用紫外誘變、氯化鋰誘變、以及二者復(fù)合誘變，然后用非

2、酶法檢測PQQ產(chǎn)量，所得3株菌U1，U2和L1的PQQ產(chǎn)量較高且遺傳穩(wěn)定，分別是出發(fā)菌株的6倍、2.7倍和5倍。利用紫外線-氯化鋰進(jìn)行復(fù)合誘變得到一株是出發(fā)菌株產(chǎn)量1.4倍的菌株。
　　 2、本論文對PQQ的HPLC檢測條件進(jìn)行了探索，綜合PQQ的特殊結(jié)構(gòu)及文獻(xiàn)報道，通過不同波長、不同流速時PQQ吸收峰的對比，最終確定了最佳檢測條件為以水和甲醇、磷酸為流動相（體積比為95％∶5％∶5‰），流速0.8ml/min，波長200 nm

3、。同時以不同濃度的PQQ標(biāo)準(zhǔn)品繪制了PQQ濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2達(dá)到0.9936。
　　 3、本論文首次從PQQ的分泌表達(dá)方面入手，通過克隆大腸桿菌中的孔蛋白OmpA，phoE，與含卡那霉素啟動子的pET-28a-kan相連，同時根據(jù)不同抗性的質(zhì)?？梢栽谕痪曛泄泊?，克隆氯霉素抗性基因替換載體上的卡那抗性基因。得到PQQ產(chǎn)量最高為雙質(zhì)粒工程菌K.p(pET-kan-pqq，pET-kan-phoE-Cm)，最高為224.82 m

4、g/L，比原始菌株K.p提高了116.65％，為PQQ分泌表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
　　 4、本論文克隆了pET-22b載體上的信號肽序列，將其連接到載體pET-28a-pqq上的T7啟動子之后，pqq基因簇之前，對構(gòu)建好的工程菌E.coli BL21(pET-28a-pelb-pqq)進(jìn)行發(fā)酵，PQQ最大產(chǎn)量達(dá)到40.73 mg/L，比對照菌E.coliBL21(pET-28a-pqq)提高了20.68％，說明信號肽的表達(dá)促進(jìn)了PQQ

5、的分泌，提高了PQQ的產(chǎn)量。
　　 5、本論文利用不同抗性構(gòu)建了同時含有表達(dá)載體pET-28a-pqq和pET-22b-gcd的雙質(zhì)粒工程菌E.coli BL21(pET-28a-pqq，pET-22b-gcd)，48 h后90％的細(xì)胞能同時含有兩個質(zhì)粒，雙質(zhì)粒工程菌的PQQ產(chǎn)量最高可達(dá)199.8 mg/L，是對照菌E.coli BL21(pET-28a-pqq)的4倍，且該工程菌的生長速度比單質(zhì)粒的工程菌快，其葡萄糖利用率也明